分子生物学实验.pptx

分子生物学实验(1)小麦基因组DNA提取及其检测 ;实验室规则;实验室规则;实验报告内容;建议我班分成4个小组（卫生、考勤） 1人提取1份基因组 ;小组长职责： 每次上实验课前，请确认你的组员是否到齐 组织协调好组员的实验分工 每次实验结束时，和你的组员一起整理好实验台面 请收齐实验报告，并按时递交 及时反馈同学对课程的意见;基因克隆;实验一 小麦基因组DNA提取及其检测;一、实验目的要求;二、实验材料和用具;二、实验材料和用具; (机械方法)将生物组织破碎 ------液氮 研磨 (化学方法)将细胞破碎，生物大分子释放 ------提取缓冲液 (化学方法)将核酸与蛋白质分开 即蛋白质变性（核酸保持可溶状态） ------氯仿/异戊醇（24:1） (化学方法)使核酸变性，并通过离心将核酸沉淀并浓缩 ------异丙醇或无水乙醇;研钵、液氮、水浴锅 1、注意安全、湿手勿碰 2、尽量磨碎、均匀粉末 3、尽快分装，避免返潮，马上加入提取缓冲液 水浴锅 防止干烧、加蒸馏水 ;移液器;离心机;四、实验内容和方法;（一） 基因组DNA提取;水平型平板电泳槽 ;DNA Marker;使用说明书;电泳图谱的识别;1) 准备胶板，置梳子； 2）取250 mL锥形瓶，用电子天平称取琼脂糖0.5 g； 3) 加入1×TAE电泳缓冲液50 mL(即1%琼脂糖)，混匀； 4) 用微波炉融化，至澄清透明；待冷却至65 oC，加入5μL 荧光染料GoldView，混匀，倒胶，冷却凝固； 5) 置胶板于微型电泳槽后，倒入1×TAE电泳缓冲液，刚刚没过胶1mm； 6) 将2μL上样缓冲液（6× loading buffer）与2～4μL DNA溶液在PCR管里混合均匀，点样，电泳时点样孔靠近黑色的负极一侧（120 ～150V /40 min）； 7) 紫外成像并分析。 ;2;（三）DNA浓度检测--OD值测定;思考题;请于下次实验课时 递交实验报告;实验二 小麦actin基因和ISSR分子标记的PCR扩增及其检测 ; 1）、将1 g新鲜叶片用液氮速冻后，迅速研磨成白绿色粉末，置入1.5 ml 离心管中； 2）、加入600 uL预热的CTAB缓冲液（至少预热30min），65℃水浴提取1 hr，其中每10 min颠倒混匀1次； 3）、取出离心管，冰浴冷却5 min 后，加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），轻轻颠倒混匀，冰上静置10 min； 4）、6,000 rpm离心10 min，用剪掉尖头的枪头小心吸出上清夜500 uL（淡黄色或无色）放入新离心管； 5）、将上清夜再用氯仿/异戊醇（24:1）抽提一次，离心后小心吸出上清夜（约400-450 uL）放入新离心管； 6）、加入2倍体积预冷的无水乙醇（或用1倍体积的异丙醇），温和颠倒数次，沉淀DNA；应该发现成团的絮状沉淀。若无沉淀， -20℃下放置30 min（或过夜）； 7）、 6,000 rpm离心5 min （若有杂质，用枪头或牙签挑出DNA沉淀）； 8）、将管底的沉淀用70%乙醇洗两次，将离心管倒置在吸水纸上空气干燥； 9）、溶于200 ul灭菌的纯水（或含RNase 的TE缓冲液）；可用枪头搅拌辅助溶解。 备注：最好溶于0.01M 的TE（pH8.0）。DNA在弱碱性溶液最稳定。 10）、取5uL走琼脂糖电泳检测质量； 11）、取DNA溶液5 ul，稀释200倍，在260 nm下测量吸光值；;DNA的保存;一、实验目的要求;二、实验材料和用具;二、实验材料和用具; PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成 PCR反应体系 (25 ml) DNA模板(1-100 ng) 1.0 ml 上下游引物(10-50 pmol) 2 .0ml PCR缓冲液(pH 8.3) 2.5 ml Mg2+(0.5-2.5 mM) 2.0 ml dNTPs (0.2 mM) 2.0 ml Taq DNA聚合酶(1-2 U) 0.2- 0.5 ml 纯水补足至25 ml。;PCR循环的主要参数 预变性：90 ℃-96 ℃，2-5 min 变 性： 90 ℃-96 ℃，30s-1 min 退 火： 55 ℃-65 ℃