DNA的基本分子生物学操作(共40张PPT).pptxVIP

DNA的基本分子生物学操作（表达载体的构建）胥慧 .9第1页，共40页。基因转入及表达!如何研究某个基因的功能?遗传学 突变体 基因缺失或下调过量表达体内/体外生化反应第2页，共40页。表达载体的构建btbk转化E. coli酶切鉴定构建正确的质粒转化粗糙脉孢菌Western检测表达BTBK的菌株第3页，共40页。表达载体构建流程零、策略的设计一、PCR扩增基因二、乙醇沉淀基因三、酶切基因及载体四、琼脂糖凝胶电泳回收基因及载体五、连接六、转化大肠杆菌七、质粒的小量提取八、PCR/酶切鉴定及测序九、质粒的大量提取第4页，共40页。查找基因第5页，共40页。查找基因第6页，共40页。设计引物引物长度：18-22 ntGC含量 （DNAMAN hybrid: 50~60℃）DNAMAN检查：游离3’端 8 bp以G/C结尾酶切位点的选择 （巧用平端酶）保护碱基负义链引物注意反向考察是否移码EcoRV (buffer 3)HpaI (4)ScaI (3)SmaI (4)SnaBI (4)StuI (2 1 4)第7页，共40页。一、PCR（Phusion / Taq）5 X HF buffer: 10 μlNEB dNTPs: 0.5 μl Phusion:0.4 μl Primer 1: 0.5 μl Primer 2: 0.5 μl Template: 1 μl ddH2O: 37.1 μl 98℃ 1 min 98℃ 10 sec 25 X55℃ 30 sec 72℃1 min 72℃ 10 min 10℃ ∞Notes: 1. Phusion酶的扩增效率为每分钟2~4 kb. 2. 最后加酶！现用现取，取出冰浴。第8页，共40页。一、PCR10 X PCR buffer: 5 μlMgCl2: 3 μl dNTPs: 0.5 μl Taq: 1 μl Primer 1: 0.5 μl Primer 2: 0.5 μl Template: 1 μl ddH2O: 38.5 μl 94℃ 5 min 94℃ 30 sec 30 X55℃ 30 sec 72℃2 min 72℃ 10 min 10℃ ∞ 请爱护PCR仪！ 反应完及时取出；散热5分钟；严禁过夜。第9页，共40页。问题篇 P不出来： 从自己操作检查起；负义链引物是否忘记反向了；退火温度是否合适（考虑降温）；换模板；换Taq试；重设引物。大于5 kb的基因考虑分两段。 量太少： 增大模板量；降温；多P几管。 非特异条带： 若目的条带比非特异亮，大胆升温；若非特异比目的带大，严格控制延伸时间；胶回收目的带作模板再PCR。 大小不对： 温度；模板；重设引物。第10页，共40页。二、乙醇沉淀DNA1. 合并PCR产物，用TE buffer将体系扩大至 200 μl，混匀。加入2~2.5 V无水乙醇、1/10 V醋酸钠(3M, pH 5.2)，混匀。2. 置于-80℃ 30 min以上,或者，液氮速冻。3. 4℃ 12000 rpm离心15 min，倒掉上清。4. 70%乙醇洗沉淀，吸尽上清，烘干。5. 以适量ddH2O溶解DNA。Notes: 离心后迅速倒掉乙醇，切忌反复看到底有没有沉淀； 可加完70%乙醇后再适当离心； 烘干后保持EP管竖直向上； 充分溶解DNA。第11页，共40页。三、酶切 做酶切前必须研究NEB产品目录！EcoRI第12页，共40页。三、酶切25度的50度的、60度的……第13页，共40页。三、酶切第14页，共40页。三、酶切酶切反应体系 50 μl体系 5 μl体系 buffer 1/2/3/4/U : 5 μl 0.5 μl DNA: x μl a μl Enzyme:1.5~2 μl0.3 μl ddH2O: 补足第15页，共40页。三、酶切反应的温度: 大多数酶的最适反应温度是37℃。 25℃酶：ApaI SmaI 50℃酶：反应时间:（NEB快速酶切产品: 5 min） 一般2 h。 若切末端的几个碱基，延长时间。 研究NEB产品目录！第16页，共40页。三、酶切第17页，共40页。三、酶切EcoRIPstI----TTGATGAATT