药食同源食品抗氧化评价硫代巴比妥酸反应物法（TBARS）、铁离子还原能力（FRAP）测定.docxVIP

附录4 硫代巴比妥酸反应物法（TBARS） 1 目的 利用TBARS法进行样品的抗氧化能力评价。 2原理 丙二醛(Malondialdehyde, MDA)是一种生物体脂质氧化的天然产物。动物或植物细胞发生氧化应激(oxidative stress)时，会发生脂质氧化。一些脂肪酸氧化后逐渐分解为一系列复杂的化合物，其中包括MDA。此时通过检测MDA的水平即可检测脂质氧化的水平，因此MDA的测定被广泛用作脂质氧化的指标。丙二醛在较高温度及酸性环境中可与TBA发生反应，形成红色的MDA-TBA加合物，MDA-TBA加合物在535nm处有最大吸收，据此可以通过比色法进行检测。另外，MDA-TBA加合物也可以在535nm被激发产生最大发射波长553nm，据此也可以进行荧光检测。 3 试剂或材料 四乙氧基丙烷，硫代巴比妥酸 4 仪器设备 荧光分光光度计、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管。 5 操作步骤 5.1 试剂配制 10 mmol/L四乙氧基丙烷（贮备液，棕色瓶4 ℃保存12个月），临用前用纯水稀释成1 nmol/mL； 29 mmol/L硫代巴比妥酸工作液：硫代巴比妥酸 0.209 g， EDTA.2H20 25 mg，谷胱甘肽（还原型） 1 mg，用0.02 mol/L NaOH 50 mL 溶解（微温助溶，棕色瓶4℃保存2周）； 酸水解液：0.1mol/L H2SO4 125 mL，0.1mol/L Na2SO4 125 mL 加水150 mL用 H2SO4 调pH 1.5，加水稀释至500 mL。 5.2 标准曲线制作 将10 nmol/mL四乙氧基丙烷，用双蒸水稀释成0.0、0.25、0.5、1.0、1.5、2、3、5、10 nmol/mL。分别取0.1 mL加入酸水解液 2 mL 、TBA工作液0.5mL混匀，避光、沸水浴60 min，流水冷却至室温，用3mL正丁醇振荡抽提1 min，3000 r/min离心5 min；取上清液（正丁醇层）测荧光强度（入射狭缝1.5 nm，出射狭缝5 nm，激发波长536 nm，发射波长550 nm） 以四乙氧基丙烷浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标作图。 5.3 样品测定 取测试物0.1 mL，加入酸水解液 2mL、TBA工作液0.5mL，混匀，避光、沸水浴60 min；流水冷却至室温；3 mL正丁醇振荡抽提1 min，3000 r/min离心5 min，取上清液（正丁醇层）测荧光强度（入射狭缝1.5 nm，出射狭缝5 nm， 激发波长536 nm，发射波长550 nm）。 表1 实验试剂的添加量（mL） 空白组 样品组 标准组 蒸馏水 0.1 ? ? 样品 ? 0.1 ? 标准品 ? ? 0.1 酸水解液 2 2 2 TBA工作液 0.5 0.5 0.5 6 结果计算 过氧化脂质含量计算公式如下： 式中： A——空白管荧光值 B——样品荧光值 F——四乙氧基丙烷荧光值 C——四乙氧基丙烷浓度（1nmol/mL） K——稀释倍数 附录5 铁离子还原能力（FRAP）测定 1 目的 应用铁离子还原能力对样品的抗氧化能力进行评价。 2 原理 基于氧化还原反应的比色法，在低pH的溶液中，Fe3+-TPTZ（Fe3+-三吡啶三嗪）被抗氧化剂还原成Fe2+-TPTZ，使反应液变成深蓝色，在593 nm处有最大光吸收，这样通过测量样品吸光度的变化来测量其抗氧化能力。吸光值越高表示样品的还原力也就越强。 3 试剂或材料 TPTZ，乙醇，盐酸，醋酸钠，醋酸，硫酸亚铁，硫酸 4 仪器设备 紫外分光光度计 5 操作步骤 5.1 试剂配制 样品液：用乙醇配制浓度分别为0.24, 0.48, 0.72, 0.96, 1.20 mg/mL样品溶液。 40 mmol/L盐酸溶液：取浓盐酸(12 mol/L) 0.1 mL加水至30 mL，置于避光处，备用。 0.3 mol/L醋酸钠缓冲溶液：称取醋酸钠5.1 g，加冰醋酸20 mL，用水稀释定容至250 mL，置于避光处，备用。 10 mmol/L TPTZ溶液：称取TPTZ样品31.233 mg，用40 mmol/L的盐酸定容至10 mL，置于冰箱中冷藏备用。 FRAP工作液：2.5 mL 10 mmol/L的TPTZ溶液，2.5 mL 20 mmol/L 的FeCl3·6H2O和25 mL 0.3mol/L的醋酸缓冲液（pH3.6）混合均匀即得。 5.2 FeSO4标准曲线的绘制 准确称取6.08 mg硫酸亚铁，溶于适量的水中，加入18 mol/L的硫酸0.25 mL, 再加水稀释至50 mL容，并置入小铁钉。取上述溶液5 mL, 加入5 mL水，定容至50 mL，为800 μmol