药食同源食品抗氧化评价清除DPPH、ABTS+自由基法、抗氧化能力指数（ORAC）测定.docxVIP

附录1 清除 DPPH?自由基法 1 目的 利用DPPH?自由基进行样品的抗氧化性能评价。 2 原理 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）是一种暗紫色棱柱状结晶，在无水乙醇溶液中呈深紫色，DPPH?自由基在可见光区517 nm处具有较强吸收峰。该法通过DPPH提供的1个稳定的DPPH?自由基与抗氧化性受试物提供的1个电子配对结合，使DPPH?自由基的特征性紫色消失，变为无色或浅黄色，通过紫外可见分光光度计测定反应后的吸光度，根据吸光度值的变化评价受试物的抗氧化能力。 3 试剂或材料 DPPH（C18H12N5 6 ，CAS：1898-66-4） 无水乙醇 4 仪器设备 分光光度计，波长范围为400 nm～800 nm，吸光度值精确至0.001。 电子天平，感量为0.0001 g。 5 操作步骤 5.1 DPPH溶液制备 精确称取DPPH 0.0050 g，无水乙醇溶解，超声波清洗机300 Hz～1000 Hz避光超声25 min，使其充分溶解后，无水乙醇定容至 100 mL，配制成 50 μg/mL 的 DPPH 溶液，作为 DPPH 测定溶液。该溶液应现用现配。 5.2 样品制备 待检测样品溶液：精确称取待测样品 0.0100 g，蒸馏水定容至 1.0 mL，充分混合均匀，配制成 10.0 mg/mL 的母液a 。用蒸馏水将母液稀释至不同倍数，得到不同浓度的待测定溶液b 。 注a ：水溶性好的样品，直接用蒸馏水溶解与定容；水溶性差的样品，先溶于二甲基亚砜（DMSO），再用蒸馏水定容。 注b ：待检测样品溶液浓度的选择依据，应使其清除率在 35%～65%，线性方程的 R2≥ 0.9000。 5.3 标准品制备 精确称取标准品0.0100 g，蒸馏水定容至 1.0 mL，充分混合均匀，配制成 10.0 mg/mL 的母液。用蒸馏水将母液稀释至不同倍数，得到不同浓度的测定溶液c。 注c ：标准品溶液浓度的选择依据，应使其清除率在 35%～65%，线性方程的R2 ≥0.9000。 5.4 测定 取 3 支试管，分别编号为 1、2、3 号，每支试管中按照表1的组合添加试剂。 在 1 号试管中加入 3.0 mL DPPH 溶液和 1.0 mL待检测样品溶液，作为实验组（As）；在 2 号试管中加入 1.0 mL待检测样品溶液和 3.0 mL 无水乙醇溶液，作为对照组（Ac）；在 3 号试管中加入 3.0 mL DPPH 溶液和 1.0 mL 样品溶剂溶液，作为空白组（Ab）。分别充分混合均匀后，室温避光反应 30 min，于波长 517 nm 条件下，用紫外分光光度计测定其吸光度值（样品溶剂调零校准）。 表 1 实验试剂的添加量（mL） 实验组 对照组 空白组 DPPH 3.0 ? 3.0 待检测样品 1.0 1.0 ? 样品溶剂 ? ? 1.0 无水乙醇 ? 3.0 ? 本测定方法设定阳性对照组，为标准品溶液，将标准品替代上述测定方法中的待检测样品溶液，其余同上述测定方法。 6 结果计算 清除率计算公式如下： 式中： As——待检测液与 DPPH 溶液混合液的吸光值 Ac——待检测液与无水乙醇溶液混合液的吸光值 Ab——DPPH 溶液与样品溶剂溶液混合液的吸光值 以样品浓度的自然对数值为横坐标，以清除率为纵坐标，建立样品浓度与清除率的线性方程（R2 ≥ 0.9000），通过拟合方程计算半数清除率EC50，按下式计算样品的抗氧化能力AO值。 式中： AO——抗氧化能力 EC50待测样品——待测样品的半数清除率（mg/L） EC 50标准品——标准品的半数清除率（mg/L） 附录2 清除 ABTS + 自由基法 1 目的 利用ABTS +自由基进行样品的抗氧化性能评价。 2 原理 2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（ABTS）经氧化后生成较稳定的蓝绿色ABTS+ 自由基，在可见光区734 nm处有最大吸收峰，受试物与ABTS+自由基反应后使其褪色，在734 nm处的吸光值降低，通过分光光度计测定反应后的吸光度，根据吸光度值的变化评价受试物的抗氧化能力。 3 试剂或材料 ABTS（C18H24N6O6 S 4 ，CAS：30931-67-0） 乙醇、过硫酸钾 蒸馏水。 4 仪器设备 分光光度计，波长范围为400 nm～800 nm，吸光度值精确至0.001。 电子天平，感量为0.0001 g。 5 操作步骤 5.1 ABTS溶液制备 精确称取 ABTS 0.2000 g，过硫酸钾 0.0344 g，溶于 52 mL 蒸馏水，摇匀，室温避光放置 24 h 后，作为 ABTS 母液。取适量 ABTS 母液，用 95%乙醇稀释至吸光度值在 0.70±0.02 内（OD 734nm ），作为 A