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免疫共沉淀 (Co-IP) 详细步骤教程 一、原理：免疫共沉淀（ Co-Immunoprecipitation ）是以抗体和抗原之间的专一 性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。 是确定两种蛋白质在完整 细胞内生理性相互作用的有效方法。 其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时， 完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。 如果用蛋白 质 X 的抗体免疫沉淀 X，那么与 X 在体内结合的蛋白质 Y 也能沉淀下来。目前多 用精制的 prorein A 预先结合固化在 argarose 的 beads 上，使之与含有抗原的 溶液及抗体反应后， beads 上的 prorein A 就能吸附抗原达到精制的目的。这种 方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合； 也可用于确定一种特定蛋白质 的新的作用搭档。 其优点为：（ 1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（ 2 ） 蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（ 3 ）可以分离 得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：（ 1）可能检测不到低亲和力和 瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（ 2 ）两种蛋白质的结合可能不是直接结合， 而可能有第三者在中间起桥梁作用；（ 3）必须在实验前预测目的蛋白是什么， 以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具 有冒险性。 二、准备工作： 预冷 PBS，RIPA Buffer ，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机 1. 用预冷的 PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干 PBS； 2. 加入预冷的 RIPA Buffer(1ml/107 个细胞、 10cm培养皿或 150cm2培养瓶， 0.5ml/5 ×106 个细胞、 6cm培养皿、 75cm2培养瓶 ) 3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下， 把悬液转到 1.5EP 管中， 4℃，缓慢晃动 15min （EP管插冰上，置水平摇床上） 4. 4℃， 14000g离心 15min，立即将上清转移到一个新的离心管中 5. 准备 Protein A agarose ，用 PBS 洗两遍珠子，然后用 PBS配制成 50%浓度， 建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠 6. 每 1ml 总蛋白中加入 100 μl Protein A 琼脂糖珠 （50%），4℃摇晃 10min（EP 管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景 7. 4℃，14000g 离心 15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除 Protein A 珠子 8. (Bradford 法) 做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释 1： 10 倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在 - 20℃保 存一个月） 9. 用 PBS将总蛋白稀释到约 1 μg/ μl ，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果 兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如 10 μg/ μl ） 10. 加入一定体积的兔抗到 500 μl 总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不 同细胞系中的多少而异 11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温 2h，激酶或磷酸酯酶活性