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RT-PCR常见问题分析;一 、 RT-PCR反应原理与方法
RT-PCR是将RNA反转录（RT）和以反转录产物cDNA为模板的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的DNA片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因的表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因cDNA序列等研究。; 1 RT-PCR反应步骤：
第一，RNA提纯；
第二，RT逆转录；
第三，PCR聚合酶反应;;2 RT-PCR方法
2.1 一步法：即反转录和PCR扩增在同一管内完成， 有助于减少污染，灵敏度更高
2.2 两步法：即反转录和PCR扩增分两步进行，首先从RNA模板反转录得到cDNA，得到的cDNA再进行一次或多次不同的PCR反应。;2.3 一步法与两步法区别：
一步法RT—PCR反应更加快速、灵敏，操作简便，污染率低，RNA二级结构减少，并且因为聚合酶有校正活性，从而降低了PCR反应的错配率。而在两步法中，两步法在选择聚合酶和引物时具有更大的灵活性，同时可由一次反转录样品获得多个遗传信息，并且由于在第一步中将RNA反转录为cDNA，从而更易于保存。另外，两步法的整个过程比一步法更节省费用。;3 提高RT-PCR反应的灵敏度与特异性：
3.1 首先应确定模板RNA完整性好，无DNA污染。
3.2 RNA模板中不应含有扩增反应抑制剂。
3.3 为了防止模板降解，可以在反应体系中加入RNase抑制剂RNasin。
3.4 使用适量的模板RNA，模板量太多会降低特异性，太少会导致扩增不出条带或条带太弱。
3.5 如果由于模板有二级结构，导致扩增效果不好，可提高逆转录反应温度。
3.6 设计引物时，避免在引物3′端含有互补序列，避免可以形成内部发卡结构的序列。;
RT-PCR常见问题
; ;;;;;;;;;;问题二：产生非特异性条带;;;;问题三：产生弥散条带;;问题四：灵敏度低，须在比预期更高的循环中检出产物? ;;问题五：信号高于预期，在低于预期的循环中即可检出产物?;问题六：电泳后出现意外的条带 RNA? ;问题七:产生大分子量的弥散条带 ;问题八： 在无反转录酶的情况下，对照RNA获得扩增结果;问题九： 扩增产物滞留在加样孔中;;
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