扩增基因全长实验技术.pptVIP

无忧PPT整理发布 第一页，共16页。 获取(huòqǔ)基因全长简介 基因初步(chūbù)验证 基因全长获取(huòqǔ)（RACE技术） RACE产物鉴定 4 1 2 3 以介绍5’RACE技术为主 5 对序列进行生物信息学分析 目录 第二页，共16页。 为什么要获取基因(jīyīn)全长？ 什么是EST？ 获取基因(jīyīn)全长基本流程？ 获取(huòqǔ)基因全长简介 EST (Expressed Sequence Tag)表达序列标签(biāoqiān)—是从一个随机选择的cDNA 克隆，进行5’端和3’端单一次测序挑选出来获得的短的cDNA 部分序列,代表一个完整基因的一小部分,在数据库中其长度一般从20 到7000bp 不等,平均长度为360 ±120bp 。 获取全长cDNA是研究 基因功能的关键，是 进行基因功能及产物 分析的必要前提。 第三页，共16页。 获取(huòqǔ)基因全长基本流程 构建(ɡòu jiàn)数据库 筛选(shāixuǎn)EST序列 普通PCR进行初步验证 RACE技术 生物信息学分析 库 筛选EST 基因初步验证 获取基因全长 进行全序列分析 以本实验室具体情况为例子 第四页，共16页。 生物(shēngwù)信息学分析 Blast比对 ORF比对 相似序列多重比对 家族(jiāzú)成员多重比对 PCR扩增 凝胶回收(huíshōu) 测序 设计引物 提取RNA 反转录 PCR扩增 Ⅰ电泳检测 Ⅱ凝胶回收 Ⅲ电泳检测 Ⅳ克隆 PCR产物测序 凝胶回收测序 克隆后菌液测序 克隆后质粒测序 基因初步验证 第五页，共16页。 RACE技术(jìshù) 方法(fāngfǎ) RACE 简介(jiǎn jiè) 试剂盒 选取 5’RACE 原理 实验 过程 基因全长获取 第六页，共16页。 cDNA末端快速扩增 (rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术是基于PCR技术由已知的部分(bù fen)cDNA序列来获得完整cDNA序列的一种方法。 分为(fēn wéi)3’RACE 和5’RACE RACE 简介(jiǎn jiè) 第七页，共16页。 Clontech公司(ɡōnɡ sī) 全称(quán chēnɡ)： SMART RACE cDNA amplification kit 优点： 操作简便(jiǎnbiàn)，成功率较高，全长分子的比例较高 价钱：中等偏上。 缺点： 不知道能否拿到完整的5’UTR. 试剂盒 选取 第八页，共16页。 5’RACE 原理(yuánlǐ) 5’ polyA 3’ Oligo(dT)primer 5’ polyA 3’ cDNA第一条链合成(héchéng)机制 polyA 3’ polyA 3’ 3’ 5’ 第九页，共16页。 5’RACE 原理(yuánlǐ) polyA 3’ 5’ 3’ LUP Suppression PCR:阻抑(zǔ yì)聚合酶反应 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ GSP1 3’ GSP1 SUP 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 第十页，共16页。 实验(shíyàn) 过程 合成(héchéng)cDNA第一条链 （1）制备(zhìbèi)A管：加好后放在室温下。共计4ul。 2.0ul 5X First-Strand Buffer 1.0ul DTT(20 mM) 1.0ul dNTP Mix(10 mM) 4.0ul Total Volume （2）制备B管：冰上操作。 1.0-2.75ul RNA 1.0ul 5-CDS Primer A 再加入无菌水，使体积达到3.75ul。 混合溶液，并用掌上离心机离心。72℃ 3分钟，42℃ 2分钟。此过程可在PCR仪中进行。之后14000g离心10s。如果是做5’RACE，则加入1ul SMARTer IIA oligo。 此时B管体积为4.75ul。 第十一页，共16页。 实验(shíyàn) 过程 合成(héchéng)cDNA第一条链 （3）在上一步放入PCR仪中后，在之前放在室温(shì wēn)下的A管中加入：（室温(shì wēn)进行） 0.25ul RNase Inhibitor(40 U/μl) 1.0ul SMARTScribe Reverse Transcriptase(100 U) 加上之前A管中的4ul，此时总体积为5.25ul。 （4）将A管中的混合液体5.25u