临床检验技师临床免疫学和免疫检验荧光免疫技术讲义.pdfVIP

第八章 荧光免疫技术 第一节 概述 荧光免疫技术是标记免疫技术中发展最早 的一种。 一、荧光的基本知识 1. 荧光：某些物质受到一定波长光的激发后，在极短时间内 发射出的波长大于激发光波长的光。 2. 发射光谱：固定激发光波长 ，在不同波长下所记录到的样品所发射的荧光强度谱图。激发态电子 回 到的能级不同，发出的荧光波长就不同 。 3. 激发光谱：固定检测 发射光荧光波长 ，用不同波长的激发光照射样品所记录到的相应的荧光发射强 度谱图。 4. 荧光效率：荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率称为荧光效率。 在一定范围内，荧光强度与激 发光强度呈正相关，即激发光越强，荧光越强，但过强的激发光会使荧光很快褪去。 5. 荧光寿命：荧光物质被激发后产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间称为荧光寿命。 6. 荧光淬灭：荧光物质在某些理化因素（如紫外线照射、高温、苯胺、酚、 I - 、硝基苯等）作用下，发 射荧光减弱甚至消退，称为荧光淬灭，这是由于激发态分子的电子不能回复到基态，所吸收的能量无法以 荧光的形式发射。 7. 荧光偏振。 二、荧光物质 （一）荧光色素 1. 异硫氰酸荧光素（ FITC ）：呈现明亮的黄绿色荧光。 2. 四乙基罗丹明（ RB200）：呈橘红色荧光。 3. 四甲基异硫氰酸罗丹明（ TRITC）：呈橙红色荧光。 4. 藻红蛋白（ R-RE）：呈明亮的橙色荧光。 （二）其他荧光物质 3 ＋ 3＋ 1. 镧系螯合物：其中以 Eu 应用最广 。Eu 螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄， 荧光衰变 时间长， 最适合用于时间分辨荧光免疫测定。 2. 酶作用后产生荧光的物质： 4- 甲基伞酮 - β-D 半乳糖苷本身无荧光，受 β- 半乳糖苷酶的作用分解成 4- 甲基伞酮，后者可发出荧光。其他如碱性磷酸酶的底物是 4- 甲基伞酮磷酸盐，辣根过氧化物酶的底物是 对羟基苯乙酸等。 第二节 荧光抗体技术 一、荧光抗体的制备 （一）抗体要求 将荧光素与特异性抗体以化学共价键的方式结合而成。一般需经纯化 提取 IgG 后再作标记。 （二）荧光素要求 异硫氰酸荧光素最常用 要求： ①应具有能与蛋白质分子 形成共价键的化学基团 ，与蛋白质结合后 不易解离 ，而未结合的色素及其降 解产物易于清除； ② 荧光效率高 ，与蛋白质结合后，仍能保持较高的荧光效率； ③荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明； ④与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质； ⑤标记方法简单、安全无毒； ⑥与蛋白质的结合物稳定，易于保存。 第 1 页 （三）抗体的荧光素标记 1. 搅拌法：适用于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体溶液。 优点是标记时间短、荧光素用量少。但 易引起较强的非特异性荧光染色。 2. 透析法： 适用于标记 样品量少、蛋白含量低 的抗体溶液。此法标记比较均匀，非特异染色也较低。 （四）荧光素标记抗体的纯化 抗体标记完成后，还应对标记抗体作进一步纯化，以 去除未结合的游离的荧光素。 纯化方法可采用透析法或层析分离法。 （五）荧光抗体的鉴定 1. 荧光素与蛋白质的结合比率 荧光素与蛋白的 过量结合是非特异荧光着色的来源之一 ，而未结合者 有抑制特异性荧光抗体反应的作用。 荧光素结合到蛋白上的量的重要指标是 荧光素与蛋白质的结合比率（