虾肝肠胞虫（ehp）检测 套式pcr法-编制说明.docxVIP

浙江省地方标准《虾肝肠胞虫(EHP)检测套式PCR法》编制说明 —、项目背景 虾肝肠胞虫(Enterocytozoonhepcitopenciei, EHP)又称肠胞虫〃，属于微 泡子虫科，肠胞虫属，是一种可感染多种真核生物的专性细胞内寄生虫，2004 年最早发现于泰国养殖的斑节对虾(Penaeusmonodon), 2009年被正式命名报道。 近年来先后在澳大利亚、中国、印度、越南、印度尼西亚、马来西亚等亚太地区 主要对虾养殖国家发现，严重影响对虾正常生长，已成为阻碍对虾养殖产业发展 的重要病原。近几年的中国水生动物卫生状况报告显示，我国沿海多省份养殖虾 类虾肝肠胞虫病病原阳性检出率均高达30%以上。。 浙江省南美白对虾产量113514吨，已成为我省水产养殖的主导产业之一。 省水产技术推广总站虾已连续多年对南美白对虾苗种疫病进行监测，结果表明： 2015-2018年EHP阳性检出率逐年上升，最高可达47.1%。EHP感染虽不会造成 虾类的大量死亡，但可引起生长缓慢或停滞，严重的甚至养殖90天以上的规格 小于4克/尾，不得不采取排塘措施，经济损失惨重，严重影响了对虾养殖产业 的发展。2018年农业农村部已将EHP作为新发疫病纳入国家水生动物疫病监测, 并在其组织的水生动物防疫系统实验室检测能力测试中增加该项测试。 EHP可通过水平和垂直传播，包括经口摄食传播，或直接通过养殖水体在 对虾中进行传播，主要感染虾的肠道表皮，进而感染肝胰腺，引起对虾肠道吸收 功能下降，严重的出现肠炎和肝胰腺萎缩，导致虾生长出现迟缓。但EHP感染 无明显的早期临床症状，也并不导致对虾死亡，感染EHP的虾食欲表现正常， 并不停止摄食，空耗饲料、水电和人工等，因而，EHP早期感染不易被发现。此 外由于EHP细胞内寄生的特性，目前也未有能够杀灭或者控制其发展的有效药 物，因此早期快速检测技术的建立至关重要，从源头防控该病原的感染。 EHP虫体微小，采用苏木精伊红染色法着色不明显，组织病理学观察不容 易分辨。因此，目前对EHP的检测多依赖于分子生物学方法，己报道的方法包 括PCR LAMP法、原位杂交法和荧光定量PCR法等。综合考虑样品检测时限、 成本和结果可靠性等因素，结合我省水产体系和水产养殖基层实验室仪器配置和 人员技术现状，普通PCR法、荧光定量PCR法、环介导恒温扩增LAMP法是目前 最广泛应用、最为实用的检测技术。 目前针对EHP检测的分子方法主要针对三种基因，真核生物核糖体核糖核 酸18SrRNA、小亚单位核糖体核糖核酸(SSU)和虾肝肠胞虫孑包子壁蛋白(SWP), 但是研究发现针对18S和SSU基因设计引物的PCR方法扩增得到的核昔酸序列 与其他宿主的微孑包子虫的序列有较高同源性，检测虾类外的其他样品时容易产生 假阳性结果，只能用于虾体的病原检测。而SWP定位于成熟地子的细胞壁，与 外胚层和内胚层均有分布，参与宿主细胞的识别过程并提供抱子壁的结构支撑， 其编码基因序列特异性高，适合作为检测靶基因的鉴别，且除了虾体还能适用于 粪便、养殖水体、饵料生物等样品的虾肝肠胞虫检测，检测范围更为广泛，可用 于养殖过程中各个环节的防控，因此建立SWP-PCR法，制定本标准对科学指导 和规范我省虾虾肝肠胞虫的检测和监测具有重耍的现实意义。 普通PCR法是目前最广泛应用、最为实用的检测技术。近几年农业农村部 组织水生动物防疫系统实验室检测能力验证中几种鱼类和甲壳类病原检测方法 均为套式PCR法，省、市、县三级水生物防疫系统实验室积极参加，在测试中取 得满意成绩，具有了套式PCR方法的操作技术能力。因此将套式PCR法列入EHP 检测方法。 综合考虑样品检测时限、成本和结果可靠性等因素，结合我省水产体系和 水产养殖基层实验室仪器配置和人员技术现状，本标准根据SWP基因，建立了 SYBR q-PCR和LAMP检测方法，检测速度更快，灵敏度更高，适用范围更广。同 时LAMP快速检测方法对仪器要求低，更适用于基层检测。 二、工作简况 (一)任务来源 根据浙江省市场监督管理局《农家乐服务质量要求》等50项浙江省地方标 准制修订项目公开招标，将《虾肝肠胞虫(EHP)检测套式PCR法》标准列入规划。 (-)标准制定协作单位 本标准制订工作由浙江省水产技术推广总站主持，浙江省休闲观赏渔业行 业协会、浙江省海水水产研究所、杭州市农业技术推广中心等单位共同协作实施, 成立了标准制订小组，分工协作，开展标准的起草、审查、征求意见及审定等工 作。 （三）主要起草人及其分工 标准制定任务下达后，2019年8月，组成了标准起草工作组，明确了任务 要求，安排了工作进度。起草小组标准起草人员构成，见表1。 表3标准起草小组构成表 姓名 专业 职称 主要任务 朱凝瑜 预防兽医 工程师 项目主持人