体外受精与核移植动物.pptVIP

中国双胞胎试管婴儿 第三十一页，共69页 试管婴儿可分为三个类型： 第一代试管婴儿： 1977年，爱德华兹（Edwards ）和斯蒂普特（Steptoe)培育为第一代试管婴儿。 第三十二页，共69页 第二代试管婴儿： 1992年，Palermo的单精子卵细胞浆内注射（ICSI）是第二代试管婴儿 通过先进的显微注射仪将单个精子注射进卵子内受精培育的婴儿，因此这种方法又称为显微受精 第二代试管婴儿的技术关键在于显微操作系统与注射技术的建立等 第三十三页，共69页 第三代试管婴儿： 通过种植前遗传学诊断（PDG）技术培育出的试管婴儿将被称为第三代试管婴儿 从体外受精的胚胎取出部分细胞进行基因诊断，排出带致病基因的胚胎后再进行移植，从而实行胚胎着床前即诊断出遗传病症的愿望 1990年，世界首例PDG试管婴儿成功培育 第三十四页，共69页 第四代试管婴儿： 借助别人卵浆增强自己卵子能力 特征：卵浆置换 只要针对那些卵子质量不高、活力差的高龄女性 第三十五页，共69页 试管婴儿（第一代）技术步骤 女方超排卵与取卵 精子采集与体外获能处理 体外受精 受精卵体外培养 胚胎移植 胚胎移植（选择8细胞胚胎）与观察 子宫内发育、婴儿诞生 第三十六页，共69页 13.4 核移植动物 核移植：（cell nuclear transfer）是利用显微操作技术将一种动物的细胞核移入同种或异种动物的去核成熟细胞内的技术。 细胞核移植动物：又称为克隆动物（cloned animal），是指用特定发育阶段的核供体及相应的核受体（去核的成熟卵细胞）体外构建重组胚，通过胚胎移植到受体完成发育出生的动物。 细胞核移植动物又称为核质杂种，包括胚胎细胞克隆动物和体细胞克隆动物。 第三十七页，共69页 13.4.1 核移植动物培育流程： 1.核供体细胞获得与取核 供体核细胞可以使原代细胞或传代细胞，从来源上包括胚胎细胞、胚胎干细胞、体细胞。分离制备单个动物细胞，通常采用处于G0期细胞作为核移植的供体细胞。 第三十八页，共69页 ⑴胚细胞 用0.2%链霉蛋白酶预处理胚胎，溶去胚胎的胶膜及透明带，分离出单个卵裂球。消化透明带的时间是影响卵裂球质量的重要因素，作用时间短，透明带不能充分消化，卵裂球不易获得；作用时间长，则影响到卵质膜，容易破裂，在操作时容易失败。因此，在分离卵裂球时应在解剖镜下监视透明带的消化过程，当透明带变薄，膨胀适度时就应移出，再用适当口径的吸管吹打使之分离。另外，苏格兰学者Campbell等显微分离胚盘细胞并在体外进行缺血饥饿传代培养，诱使细胞处于“静止”状态，以便调整染色体结构，从而有助于核的重组与发育，他们使用这种方法建立了绵羊TNT4细胞系，该细胞形态类似于胚胎干细胞，但更扁平、上皮化。 第三十九页，共69页 ⑵体细胞 　最早用青蛙肠粘膜上皮细胞获得了后代。Wilmut等用绵羊乳腺细胞获得Dolly羊。美国夏威夷大学Ryuzo Yanagimachi教授领导的一个国际科研小组于1998年以小鼠卵丘细胞为核供体，采用吸移管注入，利用机械和化学激活方式进行细胞的融合，成功培育三代克隆小鼠。对小鼠、牛体细胞移植的相关研究中发现休眠（G0）的颗粒细胞核与去核MⅡ期卵母细胞构成的体细胞重构胚，其发育率及产生克隆后代的能力远高于其它类型的休眠体细胞，这可能缘于颗粒细胞上存在着与卵母细胞紧密联系的胞质微绒毛桥的缘故，它或许有助于供体核同受体核胞质因子的交换。 第四十页，共69页 细胞核移植所用受体细胞一般采用MⅡ期成熟卵细胞，可以从动物体内直接获得，但数量有限。目前，高质量的体外成熟（IVM）培养的卵细胞可以替代体内成熟卵细胞进行核移植。 2.受体细胞去核 第四十一页，共69页 受体细胞去核方法： ⑴盲吸去核法： 用细胞骨架抑制剂——细胞松弛素B或秋水仙处理卵细胞，使细胞骨架松弛。用固定管在第二极体对面吸引固定卵细胞，将外径25~30um的尖头管轻轻刺入透明带，停在第二极体附近的卵周隙中，轻轻将去核管连同其中的内容物拉出透明带，完成卵细胞去核。随后将去核管内的核驱出。去核后的卵细胞用培养液洗涤后继续培养1~2h，用作细胞核移植受体。可以用荧光染料Hoechst33342对卵细胞DNA进行染色，在紫外观察下去核可提高去核成功率。 第四十二页，共69页 ⑵功能性去核法： 通过用紫外线或激光照射使染色体失活而达到去核目的。 第四十三页，共69页 ⑶化学诱导去核： 用脱羧秋水仙碱处理激活的小鼠MⅡ期卵细胞使其排放弟二极体。由于脱羧秋水仙碱的作用，核染色质没有分开而全部进入第二极体。这样就可完成去核。这种方法可以在同一时间大量去核，