构建点突变质粒步骤.docxVIP

精品资料 精品资料 基因定点突变 一、定点突变的目的 把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。 二、定点突变的原理 通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的 PCR 产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定 就行了。 三、引物设计原则 引物设计的一般原则不再重复。 突变引物设计的特殊原则： (1)通常引物长度为 25~45 bp ,我们建议引物长度为 30~35 bp 。一般都是以要突变 的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为 11-12 bp。若两边引物太短了，很 可能会造成突变实验失败， 因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR 要求两边都能与引物搭上， 所以两边最好各设至少 12个bp ,并且合成多一条反向互补的引 物。 (2)如果设定的引物长度为 30 bp ,接下来需要计算引物的 Tm值，看是否达到78 c (GC含量应大于40%)。 (3)如果Tm值低于78 C,则适当改变引物的长度以使其 Tm值达到78 C (GC含量 应大于40%)。 (4)设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。 (5)最好使用经过纯化的引物。 Tm 值计算公式：Tm=0.41 X(% of GC) ￡75/L+81.5 注：L:引物碱基数； ％ of GC :引物GC含量。 四、引物设计实例 以GCG-ACG为例： 5’ -CCTCCTTCAGTATGTAG G CGACTTACTTATTGCGG-3 ’ （ 1 ）首先设计 30 bp 长的上下游引物，并将 A （T） 设计在引物的中央位置。 Primer #1: 5 ’ -CCTTCAGTATGTAG ACGACTTACTTATTGC-3 ’ Primer #2: 5 ’ -GCAATAAGTAAGTCG TCTACATACTGAAGG-3 ’ （ 2） 引物 GC 含量为 40% ， L 为 30 ， 将这两个数值带入 Tm 值计算公式， 得到其 Tm=75.5 （Tm=0.41 X40-675/30+81.5 ）。通过计算可以看出其 Tm低于78 C ,这样的引物是不合适 的，所以必须调整引物长度。 （ 3 ）重新调整引物长度。 Primer #1: 5 ’-CCTCCTTCAGTATGTAG A CGACTTACTTATTGC GG-3 ’ Primer #2: 5 ’-CCGCAATAAGTAAGTCG TCTACATACTGAAGG AGG -3 ’ 在引物两端加 5mer （斜体下划线处） ，这样引物的 GC 含量为 45.7% ， L 值为 35 ，将 这两个数值带入 Tm值计算公式，得到其 Tm为80.952 （Tm=0.41 47.5-675/35+81.5 ）, 这样的引物就可以用于突变实验了。 五、突变所用聚合酶及 Buffer 引物和质粒都准备好后， 当然就是做 PCR 喽， 不过对于 PCR 的酶和 buffer ， 不能用平 时的，我们做PCR把整个质粒扩出来，延伸长度达到几个 K,所以要用那些 GC buffer或 扩增长片段的 buffer ，另外，要用保真性能较好的 PFU 酶来扩增，防止引进新的突变。 除了使用基因定点突变试剂盒，如 Stratagene 和塞百盛的试剂盒，但价格昂贵。可以 使用高保真的聚合酶，如博大泰克的金牌快速 taq 酶、 Takara 的 PrimeSTAR TM HS DNA polymerase 。 六、如何去掉 PCR 产物 最简单的方法就是用 DpnI 酶， DpnI 能够识别甲基化位点并将其酶切， 我们用的模板一 般都是双链超螺旋质粒， 从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化保护起来 （除非你用的 是甲基化缺陷型的菌株） ，而 PCR 产物都是没有甲基化的，所以 DpnI 酶能够特异性地切割 模板（质粒）而不会影响 PCR 产物，从而去掉模板留下 PCR 产物，所以提质粒时那些菌 株一定不能是甲基化缺陷株。 DpnI 处理的时间最好长一点，最少一个小时吧，最好能有两三个小时，因为如果模板 处理得不干净，哪怕只有那么一点点，模板直接在平板上长出来，就会导致实验失败。 七、如何拿到质粒 直接把通过 DpnI 处理的 PCR 产物拿去做转化就行了，然后再筛选出阳性克隆，并提 出质粒，拿去测序，验证突变结果。 八、图示 PCR arnpIHiEdNottrandonnedTransformeiiqStep 1. Inducing mutotlon-I - PCR reciction PCR arnpIHiEd Nottrandonned Transformeii q Step 1. Inducing mutotlon