GLP-1R-GFP-293A稳转细胞模型构建.docxVIP

PAGE / NUMPAGES GLP-1R-GFP-293A稳转细胞减肥药物筛选模型构建 1 材料与方法 1.1 材料 胰蛋白胨、酵母提取物及琼脂糖 PCR 酶，T4 DNA 连接酶，限制性内切酶 PCR产物回收试剂盒，凝胶回收试剂盒，质粒小提试剂盒 cAMP检测试剂 细胞培养DMEM 培养基，胎牛血清 转染试剂 Lipofectamine 3000，G418 商业化制剂利拉鲁肽 异丁基-1-甲基黄嘌呤( IBMX) GFP 抗体，GAPDH 抗体 大肠杆菌 DH5α、真核表达载体 pEGFP-N3 ，HEK293A细胞株，质粒 pENTER-GLP-1R或pENTER 1.2 表达质粒的构建 以含有人源 GLP-1R 基因片段为模板，PCR 扩增 GLP-1R基因，设计上、下游引物，分别引入双酶切位点及保护碱基，编码基因不含终止密码子。PCR 产物插入 pEGFP-N3 表达质粒，具体操作如下：PCR产物和 pEGFP-N3 质粒分别用限制性内切酶双酶切后，1% 琼脂糖凝胶电泳分离、胶回收纯化，经T4 DNA 连接酶过夜连接后转化 DH5α 感受态细胞，卡那霉素(50 mg/L )筛选培养，菌落 PCR鉴定，挑取阳性克隆扩增后，提取质粒进行双酶切和 DNA 测序鉴定。最终获得重组质粒命名为 pEGFP-GLP-1R。 1.3 细胞转染及荧光观察 HEK293A 细胞接种 6 孔板中，于含 10% (V/V)胎牛血清的 DMEM 培养基，37°C、5% CO2的培养箱中培养。待细胞融合至 60% 为最佳转染状态。按 照 Lipofectamine 3000 试剂操作说明分别进行空白质粒 pEG- FP-N3 和重组质粒 pEGFP-GLP-1R 的转染，转染 5 h 后，更换为含 5% (V/V)胎牛血清的 DMEM 培养基，继续培养细胞至 24 h，荧光显微镜下观察绿色荧光信号在细胞的表达与分布。 1.4 筛选稳定表达 GLP-1R-GFP 的 293A 细胞 Lipo- fectamine 3000 介导 pEGFP-GLP-1R质粒转染细胞，转染24 h后，以 1∶10 稀释细胞接种于含 G418( g/L )的 DMEM培养液中，在10 cm培养皿继续培养，筛选至14d ，荧光显微镜下可观察到带 GFP 荧光细胞集落，板底画圈标记，操作台内仔细刮掉圈外非荧光细胞团，加 0.25% 胰酶消化细胞克隆集落转至小皿，获得稳定表达GLP-1R-GFP 的细胞，用含低浓度G418(500 mg/L ) DMEM 培养液维持培养细胞 1周后，更换为正常培养基培养。 1.5 Western blot 检测 GLP-1R-GFP 蛋白表达水平 野生型 HEK293A 细胞为空白对照组，瞬时转染 pEGFP-N3 空质粒的 HEK293A 细胞为阳性对照组，稳转 GLP-1R-GFP-293A的细胞为实验组，收集细胞，加入预冷 PBS 洗涤2遍，加入细胞裂解液后置于冰上30 min，13000 r/min，4°C 离心15 min，取上清。取 25 μg 处理后的蛋白样品进行SDS电泳，并电转移至 PVDF 膜上，含 5% 脱脂奶的TBST室温封闭1 h，分别与 GFP 一抗(1∶1000)、GAPDH 一抗(1∶1000)于4 ℃孵育过夜，TBST 洗膜后，与标记有 HRP 的二抗（1∶5 000）室温孵育 2 h，TBST 洗膜后显影曝光，对目的蛋白的分子量及表达量进行分析，GAPDH 表达作为内参。 1.6 GLP-1R-GFP-293A 细胞株的活性分析及 cAMP 检测试剂使用条件的优化 给予已上市药制剂利拉鲁肽刺激细胞产生cAMP，通过HTRF法检测 cAMP 含量的变化，检测上述获得的 GLP- 1R-GFP-293A 稳转细胞株活性。具体操作如下：胰酶消化细胞，离心 1000 r/min，5 min，收集细胞沉淀，用缓冲液(含0.5 mmol/L IBMX 和 0．1% BSA 的 PBS)重悬细胞，用快速移液器将 5μL 含有细胞的分析缓冲液加入到96孔板中，再加入5 μL的利拉鲁肽，浓度范围为0. 33×10－6～6. 4×10－3μmol/L，用透明封板膜密封，放入 37°C、5% CO2 培养箱中，孵育30 min。用移液器先后将5μL cAMP-d2 工作液和 Anti-cAMP antibody- cryptate 工作液加入到反应板相应孔中，室温避光孵育 1 h。利用多功能酶标仪检测 665 nm与615 nm 的吸光值，并用两者的比值代表 cAMP 含量，或利用标准曲线将比值换算成 cAMP 浓度。参照 cAMP 检测试剂说明书建议，以2000个细胞为检测体系，100 nmol/L的利拉鲁肽