Illumina 测序的原理和应用.pptVIP

* * 高碘酸希夫反应：在合成DNA引物链的时侯，加入一个二醇基团，也就是相邻的两个碳各接一个羟基。 在做完桥式PCR后，用高碘酸钠溶液处理，高碘酸根快速、精确地将二个醇基之间的那个碳碳键切断，从而把不要的那条DNA链从玻璃板上切断。 双端测序：在合成的引物链上加入了一个“8-oxo-G”，这个残基就成了“Fpg”的识别位点，用“Fpg”处理，Fpg就把带“8-oxo-G”基团给切掉，并把那条链给切断，并留下一带不完整糖基的磷酸基。这个磷酸基在接下来的过程中，起到了阻止链延伸的作用。在后面，要恢复3‘端羟基的时候，再用“脱嘌呤嘧啶内切核酸酶，AP-endonuclease”把带不完整糖基的那个磷酸基切掉，3’端羟基就露出来了，用来延伸。 最后一次切断：通过在合成的链中加入一个U碱基，而后在要切断这链链的时侯，用USER酶（Uracil Specific Excision Reagent，尿嘧啶链特定切断试剂）来切一下 。 * 读到第一个碱基是不是插入片段的第一个碱基？ * * Illumina 测序的原理和应用 Illumina测序流程 Data Analysis 数据分析 Sequencing 测序 Cluster Generation 簇生成 Library Preparation 文库制备 测序流程 Adapter and Library 接头和文库 接头：与flow cell结合区 Read1和Read2测序引物结合区 Index 用来区分不同样本 Illumina测序流程 Data Analysis 数据分析 Sequencing 测序 Cluster Generation 簇生成 Library Preparation 文库制备 测序流程 什么是 flow cell？ Flow cell 即流动槽，如载玻片大小，有8个通道 即8条lane。 1. Single DNA libraries are hybridized to primer lawn and extended by polymerase 2. Double-stranded molecule is denatured and original template is washed away 3. New synthesized strand is covalently attached to flow cell surface to form a bridge and extended by polymerase 4. Double-strand bridge is formed 5. Double-strand bridge is denatured and form two copies of covalently bound single-stranded templates 6. Bridge amplification cycle repeat Multiple bridges are formed dsDNA bridges are denatured and reverse strands are cleaved 9. Cleaved reverse strands are washed away and leaving a cluster with forward strands only 在Illumina的测序过程中，无论是单端测序还是双端测序，都会用到特异选择性链切断的过程。其中单端测序的要切断1次，双端测序中的两条链要先后各切断1次（共2次）。 单端测序：高碘酸希夫反应 。 双端测序： Illumina巧妙地利用了“甲酰胺基嘧啶糖苷酶（Fpg）”对“8-氧鸟嘌吟糖苷（8-oxo-G）”的选择性切断作用。 Illumina测序流程 Data Analysis 数据分析 Sequencing 测序 Cluster Generation 簇生成 Library Preparation 文库制备 测序流程 Hiseq2500 Two flow cell 10. Sequencing primer is hybridized to adapter sequence 测序引物 3‘端 5‘端 11. Only one nucleotide is added every cycle as the 3’ end is blocked 12. Clea