一种表面偶联S蛋白的外泌体及其制备方法和应用发明专利.pdfVIP

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 CN 111647557 A (43)申请公布日 2020.09.11 (21)申请号 202010418002.8 A61P 31/14(2006.01) (22)申请日 2020.05.18 (71)申请人 中国人民解放军第四军医大学 地址 710032 陕西省西安市新城区长乐西 路169号 (72)发明人 袁丽君　杨国栋　李者龙　孙汶齐　 (74)专利代理机构 北京高沃律师事务所 11569 代理人 瞿晓晶 (51)Int.Cl. C12N 5/078(2010.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 15/50(2006.01) C12N 15/867(2006.01) C07K 14/165(2006.01) A61K 39/215(2006.01) 权利要求书1页 说明书4页 序列表2页 附图1页 (54)发明名称 一种表面偶联S蛋白的外泌体及其制备方法 和应用 (57)摘要 本发明提供了一种表面偶联冠状病毒S蛋白 的外泌体及其制备方法和应用，属于生物制药技 术领域。通过瞬时转染人细胞或重组慢病毒感染 得到稳定细胞株实现适配体CP05-S蛋白重组表 达，与人血浆混合孵育，外泌体通过表面CD63膜 分子与适配体CP05结合，形成表面偶联S蛋白的 外泌体。本发明采用外泌体呈递抗原S蛋白，使制 备的疫苗，避免了免疫佐剂的毒性和病毒疫苗感 染的风险，是理想的疫苗研制策略，也是病毒入 侵途径封闭的理想策略。同时通过外泌体递送S 蛋白，可以竞争抑制新冠病毒的S蛋白与受体结 A 合，发挥封闭作用，有效阻断新冠病毒入侵，因此 7 偶联S蛋白的外泌体作为新型冠状病毒感染的抑 5 5 7 制剂，可能用于急性期新冠肺炎的治疗。 4 6 1 1 1 N C CN 111647557 A 权　利　要　求　书 1/1 页 1.一种表面偶联S蛋白的外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 1)将SEQ  ID No.1所示的DNA片段经Pme1酶切后插入到pWPI载体中，形成重组载体 pWPI-S-RBD-SD-CP05； 2)将所述重组载体pWPI-S-RBD-SD-CP05和psPAX2、pMD2.G共同转染真核细胞，包装成 慢病毒； 3)将所述慢病毒感染真核细胞后，筛选绿色荧光蛋白阳性的细胞继续培养，建立稳转 细胞株； 4)将所述稳转细胞株经培养，裂解细胞，分离含CP05-S蛋白的蛋白裂解液； 5)将所述含CP05-S蛋白的蛋白裂解液和人血浆混合孵育，提取外泌体，得到表面偶联S 蛋白的外泌体。 2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤1)中DNA片段包含编码CP05-S蛋白 的核苷酸序列；所述编码CP05-S蛋白的核苷酸序列如SEQ  ID No.2所示。 3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤2)中所述真核细胞包括293细胞。 4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤5)中所述含CP05-S蛋白的蛋白裂解 液和人血浆的体积比为0.8～1.2:0.8～1.2。 5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤5)中所述孵育的温度为23～28℃； 所述孵育的时间为50～70min。 6.根据权利要