细胞信号转导的分子机制.pptVIP

2. 序列特异性筛选 (1) RE酶切法 (2) PCR法 (3) 核酸杂交法 (4) DNA测序法 3. 亲和筛选法 学习文档 插入失活筛选带有重组载体的克隆 学习文档 α互补筛选〔蓝-白筛选〕 学习文档 菌落或噬斑原位杂交筛选重组体 学习文档 重组DNA技术操作过程可形象归纳为： 小结 分 分离获取目的基因 选 载体的选择与构建 接 目的DNA与载体连接 转 重组DNA转入受体细胞 筛 重组体的筛选与鉴定 学习文档 重组DNA技术操作的主要步骤 载体 质粒 噬菌体 病毒 目的基因（外源基因） 基因组DNA cDNA 人工合成 PCR产物 限制酶消化 开环载体DNA 目的基因 连接酶 重组体 转化 体外包装，转染 带重组体的宿主 筛选 表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交 学习文档 表达体系的建立： 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的别离纯化 〔六〕克隆基因的表达 学习文档 标准：选择标志 强启动子 翻译调控序列 多接头克隆位点 E.coli表达体系的缺少： 不宜表达真核基因组DNA； 不能加工表达的真核蛋白质； 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusion body) ； 很难表达大量可溶性蛋白。 1. 原核表达体系 (E.coli表达体系最为常用) 学习文档 优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分地域累积 缺点：操作技术难、费时、经济 转染 —— 将表达载体导入真核细胞的过程 方法：磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染 电穿孔 脂质体转染 显微注射 2.真核表达体系〔酵母、昆虫、乳类动物细胞〕 学习文档 第三节 重组DNA技术在医学中的应用 Application of Recombinant DNA Technology in Medicine 学习文档 一、重组DNA技术广泛应用于生物制药 利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界一项重大产业，并将有望成为21世纪的支柱产业。 美国Eli Lilly公司于1982年首先利用重组DNA技术合成人胰岛素并投放市场，标志着生物工程药物时代的开始。迄今为止，已有50多种基因工程药物上市，近千种处于研发状态，形成一个庞大的高新技术产业，产生了不可估量的社会效益和经济效益。 学习文档 重组DNA医药产品 产 品 功 能 组织胞浆素原激活剂 抗凝 血液因子VIII 促进凝血 颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子 剌激白细胞生成 促红细胞生成素 剌激白细胞生成 生长因子(bFGF, EGF) 刺激细胞生长与分化 生长素 治疗侏儒症 胰岛素 治疗糖尿病 干扰素(? 1b, ?2a, ? 2b, ?) 抗病毒感染及某些肿瘤 白细胞介素 激活、剌激各类白细胞 超氧化物歧化酶 抗组织损伤 单克隆抗体 利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗 乙肝疫苗(CHO, 酵母) 预防乙肝 口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗 预防霍乱 学习文档 二、重组DNA技术还应用于医学的其他诸多方面 疾病相关基因的发觉与鉴定 转基因和基因打靶 加速了人类基因组方案的完成 疾病的基因诊断和基因医治 学习文档 〔一〕克隆载体 至少有一个复制起点使载体在宿主细胞中进行自主复制，并能使克隆的外源DNA片段得到同步扩增； 至少有一个选择标志〔selection marker〕：选择标志是区分含与不含载体的细胞所必需的，包含抗生素抗性基因、β-半乳糖苷酶基因〔lacZ〕、营养缺陷耐受基因等。 有适宜的RE的单一切点：载体中一般都构建有一段特异性核苷酸序列，在这段序列中包含了多个RE的单一切点，可供外源基因插入时选择，叫多克隆位点〔multiple cloning sites，MCS〕。 1. 克隆载体应具备的根本特点 学习文档 〔1〕质粒 (plasmid) 特点: 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会给予宿主细胞一些遗传性状。 2. 常用的克隆载体 学习文档 学习文档 pUC18质粒载体图谱 学习文档 λ噬菌体DNA改造系统 λgt系列〔插入型，适用cDNA克隆〕 EMBL系列〔置换型，适用基因组克隆〕 〔2〕噬菌体(phage) M13噬菌体DNA改造系统〔含lacZ基因〕 M13mp系列 pUC系列 学习文档 柯斯质粒〔cosmid〕载体〔又称黏粒载体〕 酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial