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PH1462 PhyGet细菌膜蛋白提取试剂盒实验手册 PH1462 PhyGet细菌膜蛋白提取试剂盒实验手册 PH1462|PhyGetBacterial Membrane Protein Isolation Kit Catalog No ：PH1462Size ：?50T Storage ：Store@4℃ 本试剂盒是基于超速离心的快速提取细菌膜蛋白的试剂盒。其原理是裂解细胞后，通过超速离心分离出细胞膜和附着的蛋白质。跟传统的密度梯度离心法和去污剂法相比，本方法具有下列特点： 1. 一步式分离细胞膜和膜蛋白，密度梯度离心法简单快捷。 2. 膜蛋白纯度高，能够去除各种胞浆蛋白的污染，也能去除松散附着在细胞膜上的蛋白，所得膜蛋白主要是整合蛋白。 3. 膜蛋白完整性好，主要是由于实际中有抑制蛋白酶成分。 4. 回收效率高，一般能得到相当于总蛋白量6%的膜蛋白。 5. 可用于E. coli ，S. typhimurium ，K. aerogens ，P. aeruginosa ，C.crescentus 等细菌。 膜蛋白溶解液（取决于后续实验。如果后续实验为SDS，则用1×SDS上样液作为溶解液；如果用于2D 电泳，则使用1×等电点电泳上样液作为溶解液）。 组分Component Solution A Solution B Solution C DNase I powder 50assay 125mL 25mL 250ml 3.5mg Storage 4℃4℃4℃-20℃ REMARK: 50次的规格是指的每次40mL 菌液的小量提取，如果处理400mL 菌液，则本试剂盒能做5次。 低温冰袋运输和4℃保存，DNase I 需低温保存，有效期一年。 准备：第一次使用本试剂盒时需要将所有DNase I 干粉倒入溶液B 中，轻柔颠倒使DNase 干粉溶解。未用完的部分需要放-20℃保存，用法一：小量制备（主要用于上样量比较小的SDS电泳等实验） 1、收集20-40mL 过夜培养的细菌饱和培养液（OD420在1.5左右即可），2500g 室温离心10分钟后弃上清。 2、加入2mL 溶液A ，轻柔吹打，将细菌重悬于溶液A 中。 3、2500g 室温离心10分钟后弃上清。 4、加入0.5mL 溶液B （必须已经提前加入了DNase I 干粉），轻柔吹打使细菌重悬。注：如果细菌起始量没有20-40mL ，溶液A 的用量可以等比例降低。重悬在溶液A 中的细菌可以放-80℃长期保存。 5、用超声或French Press 方法裂解细胞。如果用French Press 方法，则需要处理至少两次，每次的压力为9.65×10E7（=14000psi ）。注意：不论用哪种裂解方法，都必须在显微镜下检查细菌是否已经裂解，否则还需要重复细菌裂解过程，直到80%以上的细菌都裂解为止。 6、2500g 室温离心8分钟后小心转移上清到新的10mL-15mL 塑料离心管中（如Beckman Optima 台式超速离心机离心管），弃沉淀（未破裂细胞）。 7、在上清（细菌裂解液）中加入5mL 预冷的溶液C ，轻柔颠倒混匀后冰浴放置30-60分钟。其间可以轻柔颠倒混匀3-5次。 8、用Bechman Optima 台式超速离心机115，000g 4℃离心60分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机，但离心力应该一致，否则有可能得不到沉淀。 9、小心移弃上清，在沉淀中加入0.2mL 溶液A ，充分吹打混匀。 10、用Beckman Optima 台式超速离心机115，000g 4℃离心60分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机，但离心力应该一致，否则有可能得不到沉淀。 11、小心移弃上清，所得沉淀放-20℃长期保存，也可以直接加入0.1mL 自备的，跟后续实验兼容的缓冲液（如1×SDS上样液中，可从本公司购买），所得膜蛋白的浓度将在1mg/mL左右。 用法二：大量制备（主要用于上样量比较大的2D 电泳等实验） 1、收集200-400mL 过夜培养的细菌饱和培养液（OD420在1.5左右即可），2500g 室温离心10分钟后弃上清。 2、加入20mL 溶液A ，轻柔吹打，将细菌重悬于溶液A 中。 3、2500g 室温离心10分钟后弃上清。 4、加入5mL 溶液B （必须已经提前加入了DNase I 干粉），轻柔吹打使细菌重悬。注：如果细菌起始量没有200-400mL ，溶液A 的用量可以等比例降低。重悬在溶液A