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叶绿体色素纸层析分离实验的关键步骤 赵子峰，张亚丽，吕辉，郑蔚虹 (黑龙江省齐齐哈尔大学生命科学学院生物学系， 161006) 生物学教学， 2003 年( 第 28 卷 )第 6 期 摘要：通过对比 85%丙酮、 95% 乙醇及乙醚三种有机溶剂在提取叶绿体色素的纸层析分离实验中发现，采 用乙醚和丙酮混合液提取叶绿体色素的方法，能取得了良好的实验效果。 1 前言 影响叶绿体色素层析实验效果主要有以下几个因素： ①取材，材料中叶绿体色素的含量高低和取材的量；②提取溶剂的选择，一个合适的提取剂，不仅要 考虑提取效果，而且还要经济节约、操作容易以及污染程度小；③滤纸，选择一种适于观察而且又操作容 易的滤纸处理方法；④层析剂，寻找一种有利于色素迅速扩散的层析剂。 在前人做过的大量实验中，有人从取材入手，通过几种材料对比而选出一种较好的材料；有人从滤纸 出发，将滤纸条改成灯芯状或用圆形滤纸代替；还有人将层析溶剂加以改进，但实验效果仍不是很理想， 原因是胡萝卜素及叶黄素含量低、色带浅。我们认为提取溶剂的选择是最关键的步骤，即如何提高提取液 中各色素含量是本实验的关键。一般情况下，各种植物叶片中的叶绿体色素总含量略有不同，但各种成分 所占比例几乎是差不多的，叶绿素与类胡萝卜素的分子比例约为 3 ：1，倘若改变提取溶液成分使黄色素含 量提高，层析的效果将大大提高。 2 材料方法 2.1 材料 选择颜色为深绿色的完整健康的菠菜叶片若干，在烘箱内 (48℃)烘干约半小时，待叶片水分失去一半 左右为宜。亦可在阴暗处阴干。然后，去掉粗大叶脉，称取 2 ｇ。 2.2 方法 实验设计分为六组。 (1)不加提取溶剂直接研磨，待研磨充分后加入丙酮，乙醚，乙醇中任何一种溶剂 10ｍＬ，过滤。所 得墨绿色溶液即为叶绿体色素提取液。 (2)不加提取溶剂直接研磨，待研磨充分后加入丙酮，乙醇，乙醚任意两种混合后的混合提取溶剂 10 ｍＬ，过滤。所得墨绿色溶液即为叶绿体色素提取液。 (3)直接研磨后，加 5 ｍＬ丙酮 (或乙醇 )，然后过滤。将过滤后的残渣溶于 5 ｍＬ乙醚中。再次过滤，最 后将两次所得的滤液混合，所得的墨绿色溶液即为提取液。 (4)取两份材料，直接研磨后分别加丙酮 (乙醇 )5ｍＬ，乙醚 5 ｍＬ，然后过滤，最后将两种滤液混合， 即得墨绿色提取液。 (5)加入 5ｍＬ水迅速研磨，然后用多层纱布过滤，向滤液中加 10ｍＬ乙醚萃取，分层。取上层深黄绿 色溶液即为所得的提取液。 (6)丙酮单独作提取剂的滤液中加少量乙醚。 3 结果 叶绿体色素纸层析分离实验结果如下表。 附表 叶绿体色素纸层析分离实验结果比较（见后） 第一组实验中各叶绿体色素含量不等，丙酮提取液中绿色素多，乙醚提取液中黄色素相对多些。 第二组实验中，当乙醚：丙酮 2 ： 1 混合作提取时，各叶绿体色素比例相当，含量较高，层析后的效 果好，各色素带清晰，分界明显。用乙醇代替丙酮，含量较高。但各色素带不清晰。 第三组的效果同第二组，但步骤繁琐，不宜采用。 第四组的效果也同第二组，但步骤繁琐，材料需要多。 第五组层析后的效果较好，各色素带清晰，分界明显，但绿色素含量相对低。 第六组层析的效果不是很好。在方法二中曾做过比例为 1： 1、 1：2 、2： 1、3 ： 1、1：3 五组同体积 的对比实验。从中得出当丙酮：乙醚为 1：2 时，提取的效率最高。 4 讨论 本实验成功之处在于获得了高浓度的叶绿体色素。从叶绿体色素的种类和含量来分析，选择不同的植 物对实验效果影响较小。但从研磨难易程度上考虑，则应选择一些象菠菜、藜等一些藜科植物的肉质化叶 片，而其中菠菜分布广泛，生长受季节影响较小，取材方便，故而取材为菠菜较好。新鲜叶片含水量相当 高，约 70% 。这样，一方面在同质量条件下降低了叶绿体色素实际含量；另一方面还可能稀释提取溶剂， 降低提取效率。研