动物细胞工程制药.ppt

编辑ppt 3、pH pH的高低对细胞各种酶的活性、细胞壁的通透性以及许多蛋白的功能都有重要的影响。动物细胞培养的最适pH为7.2~7.4，低于6.8或高于7.6时会对细胞产生不利影响，严重时会引起细胞退变甚至死亡。 4、渗透压 在细胞培养的所有操作中，为了使与细胞接触的所有液体都保持有较合适的渗透压和pH，一般都需要使用平衡盐溶液（balanced salt solution, BSS），它由无机盐和葡萄糖组成。表3-6列出了几种常用平衡盐溶液（BSS）组成。 5、温度 哺乳动物 ：（37±0.5）℃ 昆虫：27 ℃ 6、空气 二、动物细胞培养基的种类和组成 细胞种系不同对培养基的要求亦有差异，主要有三类：天然培养基、合成培养基和无血清培养基。 1、天然培养基：在细胞培养的早期阶段使用的培养基，主要为来自天然的材料如血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液以及羊水、腹水等。 优点：营养价值高 缺点：成分复杂、来源有限、成本较高 血清（serum）：纤维蛋白已被除去(如通过血凝或去纤维蛋白法)的血浆。 2、合成培养基：优点是成分明确，组分稳定，可大量生产供应。动物细胞培养中常用的有BME、MEM、DMEM、HAM F12、RPMI 1640以及ISOCOV、199和McCoy等。 缺点：无法替代一些未知成分。 解决途径合成培养基中添加小牛血清，彼此互补 上述合成培养基中主要有： 氨基酸：12种必需+谷氨酰胺 维生素：脂溶性和水溶性 糖类：葡萄糖、谷氨酰胺 无机盐：保持渗透压 其它一些特定成分如核酸的前体腺苷、鸟苷等。 为了给细胞培养以更大的方便，以便于其增殖或贴附生长，长向培养基中加入一定量的动物血清，常用的是添加5%~10%的小牛血清，杂交瘤细胞的培养中，血清可能要求的更高，常用10~20%的胎牛血清。 血清的作用机制可能为：（1）提供有利于细胞生长增殖所需要的各种生长因子和激素；（2）提供有利于细胞贴壁所需要的贴附因子和伸展因子；（3）提供可识别金属、激素、维生素和脂类的结合蛋白；（4）提供细胞生长所必须的脂肪酸和微量元素。 3、无血清培养基 无血清培养基的优点如下：①提高了细胞培养的可重复性，避免，避免了由于血清批之间差异的影响；②减少了由血清带来的病毒、真菌和支原体等微生物污染的危险；③供应充足、稳定； ④细胞产品容易纯化；⑤避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性；⑥减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰，便于实验结果的分析。 目前已经有市售无血清培养基（书中表5-8所示）。无血清培养基中都是在合成培养基内加入不同种类的添加剂所构成，大致有以下几类： （1）激素和生长因子：使用最多的是胰岛素，促进糖原和脂肪酸的合成，对细胞生长有刺激作用。（2）结合蛋白：最经常被补充的是铁传递蛋白和白蛋白。为了便于纯化，有时可用硫酸亚铁、柠檬酸铁、葡萄糖酸铁代替铁传递蛋白。 2、二倍体细胞系：原代细胞经过传代、筛选、克隆，从而从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。 WI-38、MRC-5、2BS等 3、转化细胞系：失去了正常细胞的特点，可以无限增殖。 自发转化、人为转化 Namalwa、CHO、BHK-21、Vero等。 各单位细胞库保存 4、融合细胞系 动物细胞融合技术----也称动物体细胞杂交技术，是指二个或者二个以上的动物细胞在外力作用下，合并为一个多核细胞的过程。 促融因素 （1）病毒诱导融合 （2）PEG诱导融合 （3）电场诱导融合 （4）其它诱导融合 （1）病毒诱导融合 仙台病毒、流感病毒、新城疫鸡瘟病毒、疱疹病毒等 当二种不同的动物细胞混合物中存在大量病毒时，病毒或其组分会在细胞间起粘连作用而使细胞聚集成团，细胞膜上的蛋白质和脂质双分子层产生重排、进而结合成一个整体。 随机的，无法人为控制，同时融合率较低。 （2）PEG诱导融合 当二种不同的动物细胞混合物中存在PEG时，就会产生细胞聚集作用。在除去PEG的过程中，即产生细胞融合现象。 所用的PEG分子量在1000-6000之间，一般浓度为40-50%，在37℃下作用2-3分钟，其促融效果最佳。 PEG促融合的作用机理不清，其促融作用也具有随机性，无法人为控制。 （3）电场诱导融合 将二种细胞混合物经过10-100V/cm的低强度非均匀交变电场作用时，细胞之间就会发生紧密接触，形成稳定的串珠状偶极子排列。在此基础上再对细胞实施瞬间高强度电脉冲就会发生膜击穿，不同细胞间通过膜脂质分子重排就能实现融合，形成一个双核或者多核的细胞。 一般来说，击穿电压为0.5-10KV/cm，作用时间为30-50微