10级分子实验汇总2质粒酶切.pptx

实 验 二质粒DNA的酶切鉴定及电泳检测小量酶切体系 添加顺序 无菌ddH2O 4 μl 1 10xbuffer O 1 μl 2 质粒DNA 3 μl 3 BamHI 1 μl 4 NotI 1 μl 5 ———————————————— 总体积10 ul混匀后,点动（Short）离心， 37℃酶切60分钟。背景理论知识Section 12.1.1 实 验 目 的掌握质粒DNA限制性酶切分析的方法和技术；学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和纯度的原理；了解电泳过程中各因素对测定结果的影响；掌握制胶、电泳、浓度测定的基本分析技术。2.1.2 限制性内切酶类型 I型 II型 III型特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。多数限制性内切酶识别长度为4-6个核苷酸，呈二元对称，少数识别更长的序列，有的切割后形成平端，有的形成粘端。2.1.2 限制性内切酶Sticky end or cohesive end Hind IIIBamHI EcoRINot I A|AGCT T G|GATC C G|AATTC GC|GGCC GCT TCGA|A C CTAG|G CTTAA|G CG CCGG|CG Blunt end EcoRV GAT | ATC CTA | TAGcutting sites are marked by | 2.1.2 限制性内切酶已经发现和鉴定了200多种EcoRI特异识别GAATTC及其互补碱基组成的双链片段粘性末端T4连接酶2.1.2 限制性内切酶PlasmidMarkerBamHI（661）EGFP(720bp)3962bpNotI（1398）pEGFP-N34.7kb738bp5.3kbBamHIpET28a5.37kbNotI40bpDigested2.1.2 限制性内切酶酶单位定义：在指明pH与37℃，在0.05mL反应混合物中，1小时消化1μg的λDNA的酶量为1单位。 酶反应条件：缓冲体系（多酶切原则） 酶切温度 反应时间 DNA的纯度和浓度。加样顺序：水+缓冲液+DNA+酶。2.1.2 限制性内切酶2.1.2 限制性内切酶影响限制性内切酶的因素： DNA制品中的污染（蛋白质、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS)解决办法： 增加酶反应体积以稀释可能的抑制剂 增加酶作用单位(过多的甘油抑制酶活性) 延长反应时间 （1-16小时）部分酶切和完全酶切 （克隆常用手段）酶的保存 -20℃2.1.2 限制性内切酶酶的星号活性*: 改变酶切条件时酶的识别位点专一性下降的现象。限制性内切酶识别特异性放宽。EcoRⅠ在正常情况下识别GAATTC序列发生切割，但如果缓冲液中甘油浓度超过5%，其识别位点发生松动，可在AATT处发生切割，EcoRⅠ这种特殊的识别能力叫做星活性，用EcoRⅠ*表示。星活性可造成位点切割机率不等，降解不完全。影响因素：甘油浓度12-20%，酶与DNA比例，离子强度，45%聚乙二醇(PEG)，有机溶剂，8%二甲基亚枫，二价阳离子，12%乙醇。2.1.3 琼脂糖凝胶电泳检测DNA是基因工程中的一项最基本技术,DNA、RNA检 测和分离的重要手段。特点：快速、简便、样品用量少、灵敏度高以及一次测定中可获多种信息。根据分子大小与构型形成的分子筛效应,适于分离200bp-50Kb的DNA片段。2.1.3 琼脂糖凝胶电泳[实验原理] DNA分子在高于等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在琼脂糖凝胶中时有电荷效应和分子筛效应。 在一定的电场强度下, DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应.具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样.凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA, 也可以分离分子质量相同,但构型不同的DNA分子。2.1.3 琼脂糖凝胶电泳影响泳动速率的因素电场强度 DNA在电泳条件下带负电荷，在电场作用下向正极泳动分子量大小与DNA构型 质粒三种构型的泳动速率：超螺旋 线型 开环凝胶浓度电泳缓冲液： TAE TBE（大于实际分子量） TPE 琼脂糖浓度/% 分离范围/kb 0.3 5 - 60 0.6 1 - 20 0.7 0.8 - 10 0.9 0.5 - 7 1.2 0.4 - 6 1.5 0.2 - 3 2.0 0.1 - 22.1.3 琼脂糖凝胶电泳不同浓度的琼脂糖凝胶可分离线性DNA分子的有效范围实验操作Section 22.2.1 实验