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植物中维生素C的测定作业指导书 (2%草酸浸提—2，6二氯靛酚滴定法) ? 维生素C又称抗坏血酸，天然抗坏血酸有还原型和脱氢型两种，它们都具有生物活性，同属于有效维生素C。脱氢型抗坏血酸容易发生内脂环水解而生成没有生物活性的二酮基古罗糖酸。还原型和脱氢型抗坏血酸以及二酮基古罗糖的合计称为总维生素C①。 维生素C的测定方法很多，常用的化学方法有测定还原型抗坏血酸“2，6—二氯靛酚滴定法”以及测定总维生素C的“2，4—二硝基苯肼吸光光度法”、“荧光光度法”等。本实验介绍2%草酸浸提—2，6—二氯靛酚滴定法。 方法原理 样品中的维生素C虽易溶于水，但需用酸性浸提剂(2%草酸或偏磷酸)来浸提，以防还原型抗坏血酸被空气中的氧所氧化②。浸出液中的还原型抗坏血酸可用2，6—二氯靛酚滴定法测定。 2，6—二氯靛酚是一种染料，其颜色随氧化还原状态和介质的酸碱度而异。氧化态在碱性介质中呈蓝色，在酸性介质中呈浅红色；而还原态在酸或碱性介质中均无色。 还原型抗坏血酸分子结构中有稀醇结构(—CO—CO—)，因此，具有还原性，能将2，6—二氯靛酚(氧化态)还原成无色化合物，而还原型抗坏血酸则被氧化成脱氢型抗坏血酸③。? 根据上述性质，可用2，6—二氯靛酚(氧化态)的碱性溶液(蓝色标准溶液)滴定酸性浸出液中的还原型抗坏血酸，至溶液刚变成浅红色(刚过量的未被还原的2，6—二氯靛酚在酸性介质中颜色)。 本法操作手续简便，快速，适用于果品，蔬菜及其加工制品中还原型抗坏血酸的测定，不包括脱氢抗坏血酸。样品中如含有Fe2+,Sn2+,Cu2+,SO2-3，S2O2-3等还原性杂质，则对测定有干扰。本法的目测滴定法只适用于浅色待测液。本实验介绍目测滴定法。 试剂 (1)2%草酸溶液④：20g草酸(H2C2O4·2H2O，化学纯)溶于1L水中，贮存于避光处⑤；? (2)2，6—二氯靛酚溶液⑥称取NaHCO3(分析纯)0.052g溶解在200ml水中，然后称取2，6—二氯靛酚(2，6—二氯酚—吲哚酚钠盐，NaOC6H4NC6H2OCl2)0.050g溶解于温热(＜40℃＝的上述NaHCO3溶液中。冷却后定容至250ml，过滤至棕色瓶内，保存在冰箱中，每次使用前，用抗坏血酸标定其滴定度； (3)抗坏血酸标准溶液［C(C6H8O6)=0.05mg/ml］0.0250g抗坏血酸⑦溶于2%草酸中，用2%草酸定容500ml(应现配现用)； (4)白陶土(高岭土) 操作步骤 1.2，6—二氯靛酚溶液的标定吸取含抗坏血酸0.05mg/ml的标准溶液2.00ml(V)于50ml三角瓶中，加入8ml2%草酸溶液用2，6—二氯靛酚溶液滴定，直至溶液呈粉红色15秒不褪色为止(V1)。同时做空白实验，即用2，6—二氯靛酚溶液滴定10ml2%草酸溶液(V0)，以检查草酸中的还原性杂质量(一般V0＜0.08～0.1ml＝。 2.样品的测定⑧ 称取具有代表性的样品1000g放入组织捣碎机中，加入100ml2%草酸溶液。迅速捣成匀浆⑨。在小烧杯中称取10.0—40.0g浆状样品，用2%草酸溶液将样品移入100ml容量瓶中，并用草酸定容(如有泡沫可加入1—2滴正辛醇)，摇匀过滤。若滤液有色，可按每克样品加0.4g白陶土脱色，再次过滤。 吸取滤液10.00ml(Vc含量高的样品应相应减少吸样量)于50ml三角瓶，用已标定过的2，6—二氯靛酚溶液滴定，直至溶液呈粉红色15秒不褪色为止⑩。 结果计算T=c×V/(V1-V0) 维生素C? mg/100g=［(V2-V0)×T/m］×100 式中 T—2，6—二氯靛酚滴定剂的滴定度，mg/ml;c—抗坏血酸标准溶液浓度，mg/ml；? V—吸取抗坏血酸标准液体积，ml； V1—滴定抗坏血酸标准液所消耗的滴定体积，ml； V0—滴定空白液所消耗的滴定剂体积，ml； V2—滴定试样液所消耗的滴定剂体积，ml； m—滴定时所吸取的滤液相当于样品的质量，g。 注释 ①有些资料中的总维生素C或维生素C总量是指有效维生素C； ②还原型抗坏血酸易受氧化酶作用而被空气中的氧所氧化，很不稳定。酸性浸提剂能抑制酶的活性，减少还原型抗坏血酸的氧化； ③反应式如下：  反应式区域 ? 反应式区域 ? ? ④也可用2%(m/v)偏磷酸为浸提剂。偏磷酸不稳定，切勿加热； ⑤草酸溶液不应曝置于日光下，以免产生过氧化物。当有催化剂(如Cu2+)存在时，过氧化物能破坏抗坏血酸； ⑥干燥的2，6—二氯靛酚试剂或其溶液长久贮存，有时含有分解产物，已不适用于维生素C的测定。因此，使用前应进行检查。检查方法：取15ml2，6—二氯靛酚溶液加入过量坏血酸溶液(溶于2%草酸溶液中)，若还原后的溶液有颜色，表示此试剂已不能使用；