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氨基酸总量测定作业指导书 蛋白质经水解或酶解可由大分子变成小的蛋白质成分，如水解后的产物经月示、胨、肽等最后变成为氨基酸，氨基酸是构成蛋白质最基本的物质。 水解后的蛋白质和水解前的蛋白质在物理特性、化学结构以及被吸收消化的程度上是很不相同的，其差别与水解的程度有密切关系，分析氨基酸的含量就可以知道水解的程度，也就可以评价食品的营养价值。 氨基酸不是单纯的一种物质，用氨基酸分析仪可直接测定出17种氨基酸(仪器价格昂贵，不能普便使用)，很多氨基酸可以同时存在于一种食品中，所以需要测定总的氨基酸量。它们不能以氨基酸的百分率来表示，只能以氨基酸中所含的氨(氨基酸态氮)的百分率来表示。当然，如果食品中只含有一种氨基酸，如味精中的谷氨酸，就可以从氮量计算出氨基酸的含量。 在评价蛋白质的营养价值时，除了测定蛋白质的含量，氨基酸氮量，还需要对各种氨基酸进行分离、鉴定，尤其对8种人体必需氨基酸进行定性定量分析。 1.1? 单指示剂甲醛滴定法 原理? 氨基酸具有酸、碱两重性质，因为氨基酸含有—COOH基显示酸性，又含有—NH2基显示碱性。由于这两个基的相互作用，使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，—NH2与甲醛结合，其碱性消失，破坏内盐的存在，就用碱来滴定—COOH基，以间接方法测定氨基酸的量。反应式以下面三种形式存在： ? ? ? ? ? ? ? 试剂40%中性甲醛溶液，以麝香草酚酞为指示剂，以mol/LNaOH溶液中和0.1%麝香草酚酞乙醇溶液；0.100mol/L氢氧化钠标准溶液。 操作步骤 称取一定量样品(约含20毫克左右的氨基酸)于烧杯中(如为固体加水50毫升)，加2～3滴指示剂，用0.100mol/LNaOH液滴定至淡蓝色。加入中性甲醛20毫升，摇匀，静置1分钟，此时蓝色应消失。再用0.100mol/LNaOH溶液滴定至淡蓝色，记录两次滴定所消耗的碱液毫升数，用下述公式计算氨基酸氮的含量。 计算 氨基酸态氮(%)=MV×0.014×100/W 式中：M—氢氧化钠标准溶液摩尔浓度 V—氢氧化内标准溶液消耗的总量(毫升) W—样品溶液相当样品重量(克) 0.014—氮的毫摩尔质量g/mmol 1.2? 双指示剂甲醛滴定法 原理? 与单色法相同，只是在此法中使用两种指示剂。从分析结果看，双指示剂甲醛滴定法与亚硝酸氮气容量法(此法操作复杂，但准确，不作介绍)相近。单色滴定法稍偏低，主要因为单指剂甲醛滴定法以氨基酸pH值作为麝香酚酞的终点，pH值在9.3。而双指示剂法是以氨基酸溶液的pH值作为中性红的终点，pH值为7.0。从理论计算看，双色滴定法较为准确。 试剂 三种试剂同单指示剂法 0.1%中性红(50%乙醇溶液) 操作步骤 取相同的两份样品，分别注入100毫升三角瓶当中，一份加入中性红指示剂2～3滴，用0.100mol/LNaOH溶液滴定终点(由红变琥珀色)，记录用量，另一份加麝香草酚酞3滴和中性甲醛20毫升，摇匀，以0.100mol/LNaOH标准溶液滴定至淡蓝色。按下述公式计算 计算 氨基态氮(%)=M(V2-V1)×0.014/W×100 式中 ： V2—用麝香草酚酞为指示剂时消耗标准碱液量(毫升) ??????? V1—用中性红作指示剂时碱液的消耗量(毫升) M—标准碱摩尔浓度 W—样品的重量(克) 0.014—氮的量毫摩尔质量(g/mmol) 注意事项 单色指示剂甲醛滴定法，用碱完全中和—COOH基时pH为8.5～9.5。 测定时样品的颜色较深，应加活性炭脱色之后再滴定。 1.3? 茚三酮比色法 原理 氨基酸在一定pH范围内，能与茚三酮生成蓝紫色化合物，可以比色定量。 反应式如下： ? ? ? ? ? 这种反应不是特异反应，主要根据氨基酸的性质而定。根据目前的报道，认为在一些事例中，都能观察到形成紫色的双一1，3一二酮茚。 ? ? ? ? 试剂 磷酸缓冲液(pH8.04)：制备方法如下： 先配M/15磷酸二氢钾液：取磷酸二氢钾4.5350克溶于水中，定容至500毫升。 M/15磷酸氢二钠液：称取Na2HPO4·12H2O11.9380克，溶于水中，定容至500毫升。取M/15磷酸二氢钾10毫升与M/15磷酸氢二钠190毫升混合即为pH8.04的磷酸缓冲液。 2%茚三酮液：称取茚三酮1克，溶于35ml热水中，加入40毫克氯化亚锡(SnCl2·H2O)，搅拌过滤(作防腐剂)。置冷暗处过夜，定容至50毫升。 氨基酸标准液：称取试剂纯干燥氨基酸(如异亮氨酸)0.2000克，先用少许水溶解并定容至100毫升，摇匀。从容量瓶中取出10毫升于100毫升容量瓶中，加水至刻度。每毫升含氨基酸为200微克/毫升。 操作步骤 标准曲线制备：精确吸取氨基酸标准液(200微克/毫升)0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0……毫升(相当