活细胞的鉴定方法—染色法和仪器分析法原理.docVIP

活细胞的鉴定方法一染色法和仪器分析法原理 活细胞的鉴定方法 活细胞的鉴走在生物学和医学上典有很重要的蕙义。细胞培养过程 中要随时 记录细胞的生长情况，需要经常测走细胞的存活率；在肿 瘤细胞的研究中?为 了检验各种药物对肿瘤细胞的杀伤力?也需要测定肿瘤细胞的存活率。在临床 医学中死活细胞的鉴定也有很大的 应用，例如为了检测某一男子的生育能力，测走精子细胞的存活力 是比较常 用的办法。 死活细胞的鉴走方法有很多种，常用的有染色法和仪器分析法。染 色法简便?易于操作，但是通过直接的形态观察来鉴别细胞死活， 实验结果很容易受操作者的主观因素的影响，存在一走的误差，所 以，在实际操作中也常采用一些仪器来进行精确的批量检测。 问题：这两种鉴走方法是如何进行的？原理是什么？ 01 染色法分化学染色法和荧光染色法，根据染色机理的不同〈染料或使死 细胞S 色，或使活细胞S色。死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包括：死活细 胞细胞膜通透性的差异： 活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏憧作用，只允许物质选择 性的通过；而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性壇加。常用的以台盼蓝鉴别 细胞死活的方法就是利用了这一性质。 台盼蓝，又称锥蓝,是一种阴离子型染料，不能透过完整的细胞膜。所以经台盼 蓝染色后只能使死细胞看色，而活细胞不被S色(如图)O 死活细胞在代谢上的差异： 是采用美蓝染料鉴定酵母细胞死活的依据。美蓝是一种无莓染料，氧化型为蓝色, 还原型为无色。由于活细胞中新陈代谢的作用，使细胞内輿有较强的还原能力， 能使美蓝从蓝色的氧化性变为无色的还原型，因此美蓝染色后活的酵母细胞无 色；而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们的无还原能力或还原能力极弱，使 美蓝处于氧化态，从而被染成蓝色或淡蓝色。 荧光素双醋酸K ( FDA )是一种常用的培养动植物细胞以及植物细胞 原生质体的生活力鉴定染料?其染色机理也利用了死活细胞在代谢上的 差异：FDA本身不产生荧光，也无极性，能自由渗透岀入完整的细胞 当FDA进入活细胞后，被细胞内的脂酶分解，生成有极性的、能产生 荧光的物 质一-荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜〉积累在细胞膜内，因而使有活 力的细胞产生绿色荧光；而无活力的细胞因不能使FDA分解，而无法产生荧光。 除此之外，还有一些细胞器的专有染料。如液泡系的专有染料中性红。中性红 是一种低毒性染料?可以使活细胞液泡看红色?而细胞质和细胞 核不被看色;死细 胞的液泡不被看色或浅染，染料弥敵于整个细胞中，细胞核和细胞质被染成红 色。有时侯为了壇加染色效果可以将两种染料结合使用，如甲基蓝?中性红混合 染色法。 02 可采用微电极技术（利用死活细胞膜两侧电位的差异）、全自动分析细胞记数仪 和流式细胞仪等，可对细胞的死活进行構确的批墨检测。 德国INNOVATIS出产的全自动Cedex细胞存活率/细胞计数仪/细胞分析仪（如 图），是世界上第一台高分辨率、高清晰度扫描（专利）细胞分析仪，具有全自 动台盼蓝染色、显微CCD成象、CEDEX I作站 软件，可用于制药?医学、发酵、 免疫、病理?莓性测试、生物技术等学科的研究开发和工业生产过程中的细胞计 数和分析。 Cedex HiRes 自动分析结果，检测分析数据輸岀（11项）: 总细胞数目，总细胞浓度；活细胞数目，活细胞浓度；死细胞数目，死细胞浓 度;细胞存活率（％）;细胞的平均圆度；细胞的平均直径；细胞团比例；细胞 直径分布图；细胞团分布图；细胞圆度分布图；细胞生长 时间曲线。 2 ?流式细胞仪法 用来利断细胞死活的常用荧光探针，有二大类：一类是能透过活的细胞膜进入 细胞内而发出荧光的物质，例如荧光素双 醋酸酯（FDA ）本身无荧光,进入活 细胞后可发出黄绿色荧光，若细胞有损伤则会从细胞中流失，观察不到荧光。 另一类是不能透过活细胞膜，但能对固定的细胞及膜有破损的细胞的核逬行染 色,例如碘化丙睫（PI）和漠化乙锭（一种高度灵敏的荧光染色割）就是常用 的第二类荧光探针。 碘化丙D定不能穿透细胞膜，对于典有完整细胞膜的正常细胞或凋亡细胞不能 染色。而对于坏死细胞,其细胞81的完整性畏失，碘化丙D定可以染 色坏死细 胞。目前常用的一种细胞凋亡与坏死检测试割盒则含有Hoechst 33342 （- 种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料）和碘化丙D定（PI ）两种荧光染料。细胞发 生;周亡时，染色质会固缩,Hoechst 33342可以穿透 细胞膜?染色后凋亡细胞 荧光会比正常细胞明显增强。 上述两种染料双染后?使用流式细胞仪或荧光显微篠检测时?正常细胞 为弱红色 荧光+弱蓝色荧光，凋亡细胞为弱红色荧光+强蓝色荧光?坏死细胞为强红色荧光 +强蓝色荧光。 此外，根据高中生物知识，还可以用殖物细胞的质壁分离试验来对?物 细胞的死活 逬行