DEAE--52纤维素的处理.pdf

DEAE--52纤维素的处理 关于DEAE52 纤维素的处理只有简单的几步，如下: 1.先将干粉的纤维素浸泡在蒸馏水中，一段时间大约3 小时左右，我偏爱这个时间，去除杂 质，最好抽干一下； 2.再用0.5mol/l 的HCl 溶液浸泡2 小时，用去离子水洗净至PH 中性，并抽干； 3.将抽干的纤维素再浸泡在0.5mol/l 的NaOH 溶液中2 小时，用去离子水洗至中性，抽干。 即可用了 对于用过的纤维素，可以重复利用多次，但需要经过再生处理后才可以使用。再生处理 可先用高浓度NaCl (1－2 mol/L)过柱冲洗柱床，以除去DEAE －52 阴离子交换纤维所吸附 的成份。然后，再用0.5 mol/L 的HCl 和NaOH 处理，处理方法与预处理完全相同。 DEAE－纤维素的处理及装柱 （1）处理 本实验采用的是DEAE －纤维素DE 52 是弱酸型阴离子交换剂，具体处理方法为：先将DE52 阴离子交换剂干粉浸泡于蒸馏水中，去除杂质；再在0.5N 的HCL 溶液中浸泡1－2h,再用无 离子水或蒸馏水洗至pH 值中性或PH4 以上，并将其在抽滤漏斗中抽干；将抽干的离子交换 剂浸泡在0.5N 的NaOH 溶液中1－2h，再用无离子水或蒸馏水将其洗至中性。 （2 ）装柱 将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上，加1/3 体积的无离子水，打开下出液口，水流畅通， 即刻将小烧杯中装有适宜浓度的柱材，轻轻倒入层析柱中，凝胶自然慢慢沉降再层析柱底部， 凝胶沉积直到离层析柱上端1.5－2cm 处，停止装柱。层析柱上端进液口连接恒流泵，下出 口连接蛋白质监测仪，待层析柱的平衡。 （3 ）平衡 在柱层析上样前必须对层析柱进行平衡，所谓平衡就是将层析柱中的溶液用层析过程的缓冲 液 （洗脱液）置换出来，使层析柱中的缓冲系统与柱层析过程中的系统一致。其方法是：利 用层析柱上端的恒流泵将平衡缓冲液泵入到层析柱内，打开层析柱下端的出口，平衡液流速 在0.5-1ml/min，当下出口流出液的PH 值与平衡缓冲液的PH 值一致时，层析柱达到了平衡。 在本实验中，用0.002M Tris-HCL 缓冲液PH7.4( 内含0.0001M EDTA)，预先将DE-52 柱进 行平衡。 DEAE—纤维素的活化 称取 IgDEAE32 或52 ，放入5ml 量筒中，加蒸馏水浸泡过夜，观察溶胀后 DEAE 的体积。根据所需层析柱的柱床体积计算所需 DEAE 的用量，称取所需 DEAE 用蒸馏 水浸泡过夜，其间换几次水，每次除去细小颗粒。抽干，改用 0.5ml/LNaOH 溶液浸 泡 1h 以上，抽干（可用布氏 漏斗），用无离子水漂洗，使 pH 至 8 左右（用 pH 试纸 检查）。再改用0.5ml/LHCl 溶液浸泡 1h 以上，去酸溶液，用无离子水洗至 pH6 左右。 本实验中在用前应以 0.0175mol/L ，pH6.7 磷酸盐缓冲液，浸泡平衡后使用。 DEAE—纤维素的再生 用过的离子交换剂可以反复使用，使其恢复原状的方法俗称 “再生”。再生并非每 次用酸、碱反复处理，通常只要 “转型”处理即可。所谓转型就是使交换剂带上所希望 的某种离子，如希望阳离子交换剂带上 NH+4 则可用 NH4OH 浸泡，如希望阴离子交 换剂带上 Cl—则用 NaCl 溶液处理。本实验 中 DEAE —纤维素在酸碱处理后，用 0.0175mol/L ，pH6.7 磷酸盐缓冲溶液浸泡即可转型， 以HPO4 取代 DEAE 中的OH—。 一般由于 DEAE —纤维素使用后因带有大量杂蛋白，所以再生时，先用 0.5ml/L NaOH 浸洗，用去离子水洗至 pH8 左右，再转型，即可再使用。