高效液相色谱法原理与应用.ppt

高效液相色谱法原理与应用;第1章 色谱基本原理;1.色谱法的定义; 色谱分离效果图;因此 色谱法是一种分离方法。 它的特点是：有两相，一是固定相，一是流动相，两相作相向运动。 Chromatography 将色谱法用于分析中，则称为色谱分析。 色谱分析是一种分离、分析法。; 2、色谱法分离原理;3、色谱法的分类;什么是气相色谱法？;应用举例（GC）;什么是液相色谱法？;按固定相使用的形式可液相色谱法又可分为： 柱色谱（Column Chromatography） 将固定相装在色谱柱内 纸色谱（Paper Chromatography） 用滤纸做固定相或固定相载体的色谱 薄层色谱（Thin Lay Chromatography） 固定相均匀涂在玻璃板或塑料板上 ;;丹参药材有效成分的HPLC图谱 1. Danshensu; 2. Protocatechuic acid; 3. Protocatechualdehyde; 4. Caffeic acid; 5. Salvianolic acid F; 6. Salvianolic acid D; 7. Salvianolic acid J / isomer; 8. Salvianolic acid E; 9. Rosmarinic acid; 10. Lithospermic acid; 11. Salvianolic acid B; 12. Salvianolic acid B / E /isomer ; 13. Salvianolic acid A; 14. Dihydrotanshinone I; 15. Tetrahydrotanshinone / isomer; 16. Cryptotanshinone; 17. Tanshinone I; 18. Tanshinone IIA ;; 拖尾峰 伸舌峰 鬼峰、假峰 畸峰 峰底 基线漂移 基线噪声 谱带扩张;死时间(tM):完全不保留组分流出系统的时间 保留时间(tR): 调整保留时间(t’R): 死体积(VM): 保留体积(VR): 调整保留体积(V’R):;R: 分离度 tR: 保留时间 t0：死时间 W：峰底宽度;不同R值的峰重叠情况示意图;根据该公式优化试验条件，提高分离度R。 从数学推导来看，分别增大n，α，k值，都可以提高分离度。 ;分离选择性（α）对分离度（R）的影响 ;柱效（n）对分离度（R）的影响;理论塔板数和理论塔板高度的计算方法;容量因子（k）对分离度（R）的影响;梯度洗提;;装置 低压梯度（内梯度）：溶剂在常压下混合，再用高压泵输送至柱系统。简单、经济，只需一个泵，所用溶剂的元数没有限制。 高压梯度（外梯度）：一般由两台高压泵构成，每台泵输送一种溶剂。溶剂在混合室混合后，在输入柱系统。流量精密度高，溶剂的可压缩性和热力学体积的变化可能影响输入柱子中溶剂的组成。;溶剂A;;温度的影响;三、色谱定性与???量方法;1. 色谱定性分析;实现方法 利用保留时间和保留体积定性 ;用相对保留值定性 用已知物增加峰高法定性 ;应用范围：适用于简单混合物，对该样品已有了解并具有纯物质的情况。 优点：应用简便，不需要其他仪器。 缺点：定性结果的可信度不高。 提高可信度的方法：双柱、双体系定性;(2) 与其它仪器或化学方法联合定性;离线联用方式;在线联用方式;2 色谱定量分析;（2）定量要解决的问题;峰面积的测量与计算;峰高乘半峰宽法：适于对称峰 峰高乘峰底宽度法：适于矮宽峰 峰高乘平均峰宽法：适于不对称峰 峰高乘保留值法：适于狭窄峰，快速简便，常用于工厂控制分析。;重叠峰的测量;连线分峰 计算机拟合分峰;校正因子的测量与计算; 质量校正因子 摩尔校正因子 相对响应值 ;定量方法; 校正归一化法;应用范围：当试样中各组分都能流出色谱柱，且在检测器上均有响应，各组分峰没有重叠时，可用此法。 优点：简便、准确，当操作条件如进样量等变化时，对定量结果影响很小，该法适合于常量物质的定量。 缺点：对该法的苛刻要求限制了它的使用。;面积归一化法; 内标法;适用范围：当只需测定试样中某几个组分，且试样中所有组分不能全部出峰时可用。 优点：受操作条件的影响较小，定量结果较准确，使用上不象归一化法那样受到限制，此法适合于微量物质的分析。 缺点：每次分析必须准确称量被测物和内标物，不适合于快速分析。;内标标准曲线法（多点校正内标法）; 外标法（标准曲线法）;单点校正;（3）定量中的误差问题;HPLC主要类型及其选择 ;一、化学键合相色谱法;正相色谱法与反相色谱法比较表;2. 固定相 ;类型;;不同厂商固定相的比较;3. 流动相;4. 影响