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实验五 血液葡萄糖的测定 TEL： E-mail： 光度测定法的原理及应用 光度法是利用某一物质的溶液吸收某一波段光的程度来测知该物质在溶液中的浓度。 光度法的原理 1.兰伯特—比尔定律 兰伯特(Lambert) 阐明了透过光线的强度(I)和吸收层厚度(L)的关系。 I=I010-KL I=I010-KC 比尔(Beer)又提出了透过光线的强度(I)和吸收物浓度(C)之间也具有类似的关系。 二者的结合称为兰伯特—比尔定律，其数学表达式为： I=I010-KCL log（I0/I)= KCL L 兰伯特—比尔定律数学表达式 OD＝lg（I0/I)= KCL 式中OD：光密度；描述溶液对光的吸收程度； L：液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位； c：溶液的浓度，单位g·L－１ K: 吸光系数，单位L·g－１·cm－１ ； 或: OD ＝lg（I0/I)= εCL L：液层厚度(光程长度)，为1cm； c：溶液的摩尔浓度，单位mol·L－１； ε：摩尔吸光系数，单位L·mol－１·cm－１ K与ε的关系为： K =ε/M （M为摩尔质量） 2.摩尔吸光系数ε的讨论 （1）ε在数值上等于浓度为1mol/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度。 （2）吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数；不随浓度c和光程长度L的改变而改变。在温度和波长等条件一定时，ε仅与吸收物质本身的性质有关，与待测物浓度无关； （3）可作为定性鉴定的参数； 光度法的计算 OD标＝KC标L OD测 ＝KC测L OD标＝KC标L OD测 ＝KC测L (1) 计算法（标准品法测定未知样品含量） （2) 标准曲线法 C测= OD测 OD标 × C标 0.575 光源 单色器 吸收池 检测器 显示 分光光度计的构造 1）预热仪器：为使测定稳定，将电源开关打开，使仪器预热20min，为了防止光电管疲劳，不要连续光照。预热仪器时和在不测定时应将比色皿暗箱盖打开，使光路切断。 2）选定波长：根据实验要求，转动波长调节器，使指针指示所需要的单色光波长。 3)加样：比色杯中加入空白及待测样品，并放入分光光度计中，注意：加入样品量不超过比色杯体积的2/3。且比色杯放入仪器前，要将外壁擦干净。 空白对照管1，标准管2，测定管3 分光光度计的使用 4）调模式为“透射比”：对空白对照进行调“0”（开盖）和调“100”（闭盖）。 5）调模式为“吸光度”：将仪表上“透光率T”调至“吸光率A”，轻轻拉动比色皿座架拉杆，使有色溶液进入光路，此时表头指针所示为该有色溶液的吸光度OD。读数后，打开比色皿暗箱盖。 6）关机：实验完毕，，将比色皿取出洗净，放在滤纸上凉干。关闭仪器。 注意事项1）为了防止光电管疲劳。不测定时必须将比色皿暗箱盖打开，使光路切断，以延长光电管使用寿命。2）比色皿的使用方法：①拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，不要碰比色皿的透光面，以免沾污。②测定有色溶液吸光度时，一定要用有色溶液洗比色皿内壁几次，以免改变有色溶液的浓度。另外，在测定一系列溶液的吸光度时，通常都按由稀到浓的顺序测定，以减小测量误差。 ③比色皿外壁的水用擦镜纸或细软的吸水纸吸干，以保护透光面。 ④每次做完实验时，应立即洗净比色皿。清洗比色皿时，一般先用水冲洗，再用蒸馏水洗净。 不能用碱溶液或氧化性强的洗涤液洗比色皿，以免损坏。也不能用毛刷清洗比色皿，以免损伤它的透光面。 实验原理 血糖：指血液中的单糖（葡萄糖） 葡萄糖是一种多羟基的醛类化合物。其醛基具有还原性，与碱性铜试剂混合加热，葡萄糖中的醛基被氧化成羧基，而铜试剂中的二价铜，被还原成砖红色氧化亚铜而沉淀。 氧化亚铜可使磷钼酸还原生成钼蓝，使溶液呈蓝色。其生成蓝色的深度与血滤液中葡萄糖浓度成正比。选用颜色深浅较接近于测定管的标准管一同比色，即可求出测定管中葡萄糖的含量。 福林-吴宪氏法测定血糖是在特制福林-吴宪血糖管（用前不需刷洗，要保持内壁干燥）中进行。该血糖管于4mL容量处，管颈缩小成一细管状，这样可以减少在煮沸时管内液体与空气的接触，以避免产生的氧化亚铜再氧化。 葡萄糖＋Cu2+ 葡萄糖酸＋Cu2O 磷钼酸 钼蓝 Cu2+ 全血无蛋白滤液 葡萄糖 碱性铜试剂 Cu(OH) 2 磷钼酸试剂 磷钼酸 操作步骤 （1）用钨酸法制备1：10全血无蛋白滤液