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逆转录聚合酶链式反应 RT-PCR 报告人： 一、定义 二、原理 逆转录 (reverse transcription，RT) 以RNA为模板，合成与其互补的DNA（cDNA）的过程。 逆转录酶 (依赖RNA的DNA聚合酶) 1. RNA指导的DNA聚合酶活性 2. RNA水解酶活性 3. DNA指导的DNA聚合酶活性 过 程 聚合酶链式反应--PCR 一种将微量的目的DNA片段在体外快速、大量扩增的技术。以目的DNA（待扩增DNA）分子为模板，一对分别与模板3’末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成2条新DNA链的合成。不断重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。 PCR 试管内模拟细胞内DNA半保留复制 三、方法 两步法 RT与PCR分开进行 各自在最优化的条件下进行 两步法通常是取第一步反应 产物的1/10进行第二步反应，使得其灵敏度不如一步法高。 多个基因的RT-PCR 一步法 RT与PCR同时进行 RT 和PCR 都不能在最佳条件 下进行并且容易相互干扰 简便操作、减少污染的可能性 由于得到的全部cDNA产物都一 起经PCR扩增，使得一步法的灵 敏度更高 （一）两步法 RNA的提取 反转录（RT） PCR 一、实验前准备 需准备好实验所用的试剂： 如0.1%DEPC 溶液，Trizol，氯仿，异丙醇，DEPC 水配制的75%乙醇， RNase-free 的纯水，反转录试剂盒、dNTP mix, Taq 酶, buffer、凝胶电泳缓冲液等。 所涉及到的仪器、耗材： 离心管，PCR 管，PCR仪，冷冻离心机，水平电泳槽，电泳仪等。 二、引物设计 本实验使用 Primer 6 软件设计引物。 根据 GC含量和 Tm 值，确定比较适合的引物，并保存序列。 三、总RNA的提取：TRIzol 试剂提取RNA 1. 取新鲜动物组织0.1 ～0.2g 置于组织匀浆器中，加入预冷的Trizol 液 1ml ，在冰浴中迅速匀浆15～30s ，以充分研碎组织。然后将组织悬浮液吸入另一1.5ml Ep 管中，于室温下静置5min 。 2. 加入200 μl 氯仿，剧烈振摇15s 混匀后，室温静置2~3min 。 3. 4℃，10 000r/min 离心15min ，RNA 分布于水相中。 4. 将上层无色水相转移到另一Ep 管中，加入500μl 异丙醇，室温静置10min 。 5. 4 ℃，10 000r/min 离心10min 。 6. 弃上清液，用1ml 75% 乙醇洗涤RNA 沉淀物，4 ℃，7500r/min 离心5min 。 7. 弃上清液，室温干燥15min. 8. 向干燥过的沉淀物中加入200μl DEPC 处理水溶解沉淀物，于-20 ℃保存备用。 四、反转录反应（以TianGen试剂盒为例） 1. 配制gDNA去除反应体系混合液：5×gDNA Buffer 2μl；Total RNA；RNase-Free ddH2O补足到10μl。彻底混匀，简短离心，并置于42℃孵育3min，然后放置于冰上。 2. 配制反转录反应体系混合液，10×Fast RT buffer 2μl；RT Enzyme Mix 1μl；FQ-RT Primer Mix 2μl；RNase-Free ddH2O补足到10μl。 3. 将反转录反应中的Mix加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀。 4. 于42℃孵育15min。 5. 95℃孵育3min后，将管插入冰中，-20℃保存备用。 模板DNA:基因组DNA、cDNA等 特异引物:与模板DNA特异互补的单链寡聚 dNTP片段，一般18-30bp,上下游引物 0.2-0.5 μmol/L。 DNA聚合酶:具耐热性、如Taq酶0.5-5U/100μl 底物: 等浓度的四种核苷酸（dNTP） 20-200 μmol/L 反应环境:含有Mg2＋的Tris-Cl缓冲液。 五、PCR PCR 反应的条件 预变性： 94℃，2-10min 变性：94℃, 30s, 模板DNA变性成为单链 退火：Tm-5℃,30s，引物与模板DNA结合 延伸：72℃，DNA聚合酶催化DNA合成 时间与待扩增片段长度有关， 1Kb,1min；1Kb,延长时间 重复25-30cycle. 最终延伸： 72℃， 10min。 六、凝胶电泳检测 1