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1;生产菌株来源 1、索取或购买 2、自己选育 (1) 用原有菌株进行遗传改造进行育种 ①?诱变育种 ②?基因重组育种 (2) 向菌种保藏机构索取、购买出发菌株进行选育 (3) 从自然界中分离菌种 从自然界中分离菌种就是从自然界微生物资源中有目的、快速、准确地选出所需要的菌种。 ; 设计方案→采样→增殖培养*→平板分离 →筛选(初筛、复筛)→单株纯种分离 →性能考察(生产性能试验、毒性试验、菌种鉴定） ;1 环境条件对土样本中微生物分布的影响 （1） 营养环境 ①高糖环境（加工蜜饯、糖果、蜂蜜的环境）土壤中：耐渗透压酵母，柠檬能产生菌，氨基能产生菌； ②富含淀粉环境污泥、水沟旁土壤中：淀粉酶产生菌； ③森林中腐叶烂草下土壤：纤维素酶产生菌； ④含蛋白质（蚕丝、豆饼、生皮晒厂）土壤中：蛋白酶产生菌； ⑤油田土：石油分解菌 ；;（2） 水分 ①离地表5-15cm土样 ②含水过多、过少都不理想 （3） 温度：采样以秋季为好 （4） 通风 （5）酸碱度： 细菌、放线菌：中性或偏碱； 霉菌、酵母：偏酸 ;2 采样方法 （1） 去除表层土 （2） 取5-15cm土样几十克，装入无菌牛皮低袋或逆料袋中 3 注意 （1） 记录：时间，地点，环境情况等 （2） 样品袋应封好口，防止水分失去 （3） 土样应在分离前破碎 （4） 尽快分离;二. 增殖培养（富集培养）;4 方法 （1） 控制营养成分 ?? ? ① 纤维素为唯一碳源，可增殖分解纤维素的菌 ②可溶性淀粉为唯一碳源，可增殖产淀粉酶的菌种 ③酒精废水，可以增殖废水利用菌 但：多种微生物所利用的碳源、氮源不能作控制因素 （2） 控制培养基pH 细菌、放线菌：中性偏碱，真菌：偏酸 但非目的菌的生长不能被完全抑制;（3）控制培养温度 30℃左右培养，可培殖嗜温微生物 50~60℃培养，可培殖嗜热微生物，筛选耐热菌株 （4）热处理——增殖芽孢细菌 样品悬浮液经80℃、10分钟处理，杀死营养体，再添加营养培养后可增殖产芽孢细菌;（5）添加抑制剂 10%酚数滴：抑制细菌霉菌生长，增殖放线菌 抗生素：抑制细菌放线菌，增殖酵母、霉菌 多粘菌素B：抑制G-细菌 青霉素：抑制G+细菌 制毒菌素：抑制真菌 放线菌酮：抑制真菌 ;三. 纯种分离;;第12页/共55页;第13页/共55页;（3）组织培养法：适用于分离高等真菌及植物病原菌 高等真菌：如香菇→切1小块菌盖→10%漂白粉消毒处理→无菌水冲洗→置琼脂平板上→培养→长出菌丝体 或：→悬挂在有琼脂培养基的三角瓶内→培养→长出菌丝体 注意：对蔓延性霉菌： ① 加1%去氧胆酸钠 ② 察氏培养基：0.01%蔗糖，0.1%山梨糖;2、平皿反应快速检出法——定性或半定量 （1）纸片培养显色法 滤纸饱浸含有指示剂的液体培养基 用接种环接种 保湿恒温培养 据菌落周围变色圈和菌落直径比值判别目的物产量 ;（2）透明圈法： 根据琼脂培养上透明圈/菌落直径大小判别目的产物的产量 淀粉平板透明圈：淀粉酶 碳酸钙平板透明圈：产酸 酪素（蛋白）透明圈：蛋白酶;（3）变色圈法 淀粉平板喷稀碘液：透明圈，液化型淀粉酶 支链淀粉平板喷稀碘液： 蓝色圈：异淀粉酶 无色圈：液化型淀粉酶 葡聚糖平板加刚果红：葡聚糖酶 木聚糖平板加刚果红：木聚糖酶;（4）生长圈法 工具菌： 营养缺酸型，不能合成的物质（生长因素）为目的菌积累的产物 菌落形态明显不同于目的菌 方法：106~107 工具菌与样品稀释液一起涂布至琼脂培养基表面，具有生长圈的菌落即为目的菌 适用：氨基酸，核苷酸，维生素产生菌的选育 ;（5）抑制圈 适用：抗生素产生菌的选育 工具菌：对目的抗生素敏感的微生物 例：目的菌为产生抗G+细菌的抗生素的菌株 工具菌可使用金黄色葡萄球菌;方法： 目的菌分离：稀释分离法，培养长出菌落 代谢物积累：用打孔器（6CM）将菌落连同周围琼脂培养基一起取下，放一无菌空培养皿内，保湿培养4-5天，使新产生抗生素积累于小琼脂块中 测定：取107工具菌涂布于球脂培养基，将小琼脂块放于上面培养过夜，抑菌圈的出现，说明琼脂块中有抗生素，大小说明抗生素单位的高低;第21页/共55页;3、厌氧性微生物的分离法 厌氧培养法 去除培养基中溶解氧，降低Eh 除去环境中的O2 ;（1）去除培养基中的溶解氧，降低Eh 煮沸法：将培养基置沸水中煮沸15分钟，驱除其中的溶解氧，用冷水急骤冷却，勿再摇动，Eh可降至0.1V 以下 培养基预还原：将培养基中加入还原性物质：半胱氨