基因编辑技术.ppt

CELLECTIS S.A. NASDAQ 2015.11.18 DNA剪切技术治疗1岁女童获成功 基因组编辑技术简介 Genome Editing 2015.11.22 HuangCH @ J208 修改遗传信息的第一步： 按我们的设计来重组DNA 第一节 基 本 概 念 重组DNA技术： 是指在基因水平上，将目的DNA在体外重组于能自我复制的载体DNA分子上，然后将重组DNA导入宿主细胞中进行增生，以获得大量的目的DNA片段，或以此为基础，通过基因的诱导表达，得到大量相应蛋白质产物的过程。 又称为分子克隆技术或基因工程技术 第二节 重组DNA技术的发展史 基因工程的诞生 1、Berg的开创性实验－第一个实现DNA重组 1980年Nobel化学奖 猴病毒SV40的DNA+λ噬菌体的DNA 2、Boyer-Cohen实验－第一个取得基因工程成功 1973年构建双重抗药性重组质粒 1973年是基因工程诞生的元年 第三节 工具酶 Werner Arber 理论预见限制酶 Hamilton O. Smith 得到第一个限制酶 Daniel Nathans 用限制酶切得SV40 DNA片断 1978年Nobel生理或医学奖 1、 “基因剪刀”－限制性核酸内切酶 1.定义：能识别双链DNA分子中某特定的核苷酸序列，并 在识别序列内或附近切割DNA双链结构的一类核 酸内切酶（在核酸分子链的内部制造切口的酶）。 2.来源：原核生物 Ⅰ型酶、Ⅲ型酶： 具有限制切割与甲基化修饰活性。Ⅰ型和Ⅲ型酶都没有多大的实用价值。 Ⅱ型酶： 应用广泛，能在DNA分子内部的特异位点，识别和切割双链DNA，其切割位点的序列可知、固定。 通常所说的限制性内切酶就是指Ⅱ型酶。 3.分类：根据结构、作用特点不同，分为三类。 识别位点：即为Ⅱ型酶识别的特殊DNA序列。 通常是4～8个碱基对、具有回文序列的DNA片段 5’ – G A A T T C - 3’ 3’ – C T T A A G - 5’ 4.识别和切割位点： ① 5`突出粘性末端 ② 3`突出粘性末端 ③ 平头（钝性末端） 5ˊ突出黏性末端(EcoRⅠ)： 3ˊ突出黏性末端(PstⅠ)： 平端缺口（钝性末端）( SmaⅠ） 切割方式：对dsDNA 2条链同时切割产生3种不同缺口 2、DNA连接酶 催化DNA中相邻的5ˊ端磷酸基和3ˊ-OH末端之间形成3ˊ→5ˊ磷酸二酯键。 大肠杆菌连接酶，只能连接粘性末端，T4噬菌体连接酶不但能连接粘性末端， 还能连接齐平末端。 3、DNA聚合酶 具有5`→3`聚合活性、5`→3`外切酶活性、3`→5`外切酶活性。 可用于合成双链cDNA分子或片断连接，探针制备，序列分析等。 耐热DNA聚合酶 最适反应温度为75～80℃ 具有5ˊ→3ˊ外切酶活性，不具有3ˊ→5ˊ外切酶活性 （1）5’端标记 （2）制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身 连接，提高重组效率。 碱性磷酸酶有细菌碱性磷酸酶（BAP）和牛小肠碱性磷酸 酶（CIP）。CIP能在 1% SDS溶液中68 ℃加热15 min而 失活，故CIP较为常用。 4、碱性磷酸酶 去除DNA、RNA、dNTP和NTP 5ˊ端的磷酸根。 催化单脱氧核苷酸转移到DNA3`-端羟基上。 应用：探针标记，标记测序以及制备人工黏性末端。 催化多聚核苷酸5ˊ羟基末端磷酸化。 用途：⑴放射性标记DNA的5`端 ⑵使缺少5`-磷酸基的DNA磷酸化用于连接反应。 单链核酸内切酶，降解单链DNA或RNA。 6、T4多聚核苷酸激酶 7、S1核酸酶 5、末端转移酶 第四节 重组DNA技术常用载体 是指能携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的一类DNA分子。 一、定义 分类： 克隆载体：用于在宿主细胞中克隆和扩增外 源DNA片段。 表达载体：用于在宿主细胞中获得外源基因 表达产物。 1、具备复制能力。 2、具备一个或多个筛选标志。 3、具备较多拷贝数，易从宿主细胞中分离纯化。 4、具备一个或多个限制性内切酶的单一识别点（多克隆位 点，MCS）。 5、具有较高的遗传稳定性。 二、特点 这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能：如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。 3、常用载体 质粒DNA、噬菌体DNA、病毒