核酸的序列分析.pptx

1;测序的常用方法;;测序过程: 1.模板与引物杂交 2.引物的延长和合成阻断 四个试管分别加入 DNA聚合酶 dNTP 标记底物 终止剂不同 ddA ddG ddC ddT 四个试管中所有产物是一系列长度只差一个核苷酸的聚合链 3.电泳 4.放射自显影得到直读图象;AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG 5’;AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG 5’;;反应终止后，四个反应管中的反应混合液分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离. 这四个反应管中延伸的寡核苷酸仅相差一个碱基. 电泳结构通过显色指示.;Maxam-Gilbert化学裂解法;一、化学裂解法测序的原理;碱基特异性修饰及裂解;化学法读序;第12页/共20页;化学裂解法的特点;5.3 DNA测序自动化和大规模测序; DNA自动测序与手工测序的不同点; DNA序列测定的自动化 1. DNA测序步骤与自动化 1）模板制备 可自动化 2）定序反应 可自动化 3）凝胶电泳 自动化有一定困难：制胶，点样，电泳，凝胶干燥，放射自显影。 4）核苷酸序列阅读与计算机输入 可自动化 2.自动测序仪 Conney等人于1987年设计了不同荧光染料标记引物，然后做链终止测序，用激光扫描阅读序列。 红色引物+T反应系统（引物+DNA+dNTP+ddTTP） 黄色引物+G反应系统（引物+DNA+dNTP+ddGTP） 绿色引物+A反应系统（引物+DNA+dNTP+ddATP） 兰色引物+C反应系统（引物+DNA+dNTP+ddCTP）;第17页/共20页;目前市场上已经有各种型号的DNA自动测序仪可供选购。 ;“分子生物学研究方法”思考题： 1、常用的核酸的凝胶电泳是哪两种？它们分辨DNA片段的范围有何不同？ 2、电泳操作的基本程序有哪些？ 3、核酸的分子杂交的概念？ Southern 印迹法、Northern 印迹法和Western 印迹法的检测对象分别是什么？ 4、什么叫探针（Probe)？ 5、PCR定义？简述聚合酶链式反应的基本原理？ 6、核酸测序的常用方法有哪些？ ;感谢您的观看。