原核生物的基因表达与操作.pptxVIP

3 原核生物的基因表达与操作;;目的基因 载体;大肠杆菌表达体系;大肠杆菌表达体系优越性：;大肠杆菌中表达体系的不足：;4. 许多真核基因的蛋白质产物，都要经过 转译后的加工修饰（正确折叠和组装）， 而大多数的这类修饰作用在细菌细胞中 并不存在； 5. 细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基 因所表达的蛋白质分子，并把它们降解掉。;大肠杆菌表达载体;启动子;3.2 有功能的启动子的分离;报告基因（reporter gene）：特指那些编码产物可以被快速测定的功能核苷酸编码单元（半乳糖苷酶基因、碱性磷酸酶基因、萤光素酶基因、半乳糖激酶基因以及氯霉素乙酰转移酶基因等）。 追踪某种特定的DNA结构（重组质粒）是否已经导入寄主细胞、抑或是器官和组织；也可用来同任何一种目的启动子连接，因此其表达活性可作为检测启动子功能的依据。 ;;用大??杆菌质粒pBR316筛选启动子;用pK01筛选启动子 ;检测启动子强弱的原理：;分离功能的启动子;3.3 可调控强启动子驱动的基因表达;;大肠杆菌的Lac启动子 ;大肠杆菌的trp启动子 ;Tac启动子 ;PL启动子 ;3.3.2 常用原核表达载体;融合型表达载体：----融合蛋白 非融合型表达载体：---天然完整蛋白 分泌型表达载体：----产物可跨膜分 泌至胞周间隙;3.3.3 提高蛋白的表达量;2、选择合适宿主 Lac 启动子----LacI菌 PL启动子-------- cI857 溶源菌 3、诱导表达 温度诱导------PL IPTG的化学诱导----Plac、Ptac 4、提高表达蛋白的稳定性，防止被宿主降解 ;若克隆的基因所用的密码子为宿主罕见密码子，可对外源基因进行定点突变或对宿主细菌进行改造。 ;3.3.6 非融合蛋白的表达;;非融合蛋白特点： 1、表达时要求高：SD序列与ATG的距离要 合适。即使改变2-3个碱基，表达效率也 会大受影响。 2、优点：能够较好地保持原来蛋白的活性。 3、缺点：在宿主细胞内容易被蛋白酶降 解，蛋白产量低；分离纯化费时费力， 成本较高。;非融合蛋白抗宿主蛋白酶降解方法：;融合蛋白：是指蛋白质的N末端由原核DNA 序列或其他DNA序列编码，C端由 真核DNA的完整序列编码。这样 的蛋白质有一段短的原核多肽或 具有其他功能的多肽和真核蛋白 质结合在一起，故称为融合蛋白。 ;融合型蛋白表达 ;融合蛋白的表达及纯化;例：谷胱甘肽S-转移酶标记物;融合蛋白质的纯化的基本原理：;融合蛋白质中目的蛋白的纯化;3.3.9 增强蛋白质的稳定性 3.3.10 DNA整合入宿主染色体中;3.3.11 加强分泌;;优点：;2. 蛋白质的产量高 二硫键的断裂以及转译修饰作用的丧失，会导致外源片断编码的蛋白质在大肠杆菌中超量表达。 3. 表达的质粒载体构建比较简单。 ;缺点：; 3.蛋白质会被酶解 4.蛋白质种类多，因此纯化比较复杂 ;2、周质中表达;优点： 1. 由于周质中蛋白质种类比较少，因此目标 蛋白质的纯化就比较简单 2. 蛋白质酶解的程度不甚严重 3. 促进了二硫键的形成及蛋白质的折叠作用 （氧化环境） 在正确折叠的蛋白质，在转运过程 中，在体内对信号肽进行切割;缺点： 1. 信号肽并非总是有助于蛋白质的 转运 2. 有可能形成包含体;3、胞外表达;途径： 1. 用大肠杆菌细胞固有的途径，使真正属于分 泌型的蛋白质直接分泌到胞外培养基中。 （不是特别有效的程序） 2. 诱导大肠杆菌细胞的外膜发生有限的渗漏， 导致胞内的蛋白质向胞外培养基方向分泌。 （可以分离到中等产量的蛋白质）;优点： 1. 蛋白质的酶解作用程度低 2. 由于分泌到胞外的蛋白质种类少， 因此目标蛋白容易纯化 3. 增进了蛋白质的折叠作用 ;缺点： 1. 在大肠杆菌细胞中表达的外源真 核蛋白质，通常是不会分泌到胞 外培养基中去的 2. 由于分泌在胞外培养基中的蛋白 质相当稀释，因此目标蛋白质的 纯化过程比较复杂;3.4 原核生物表达产物的分离纯化;1、包含体蛋白的提取;2、蛋白质的复性;;4、蛋白质的PEG化;3.4.5 原核表达蛋白的质量控制