植物总RNA的提取与电泳PPT参考课件.pptVIP

凝胶制备（1.2％）：用1ⅹ凝胶缓冲液配制1.2％的凝胶，至少使其凝固30分钟后进行上样； 样品制备：在离心管中，将RNA样品与10ⅹ上样缓冲液以9:1比例混匀，迅速在冰上冷浴5分钟，瞬时离心数秒。RNA上样量为2-30?g，本次实验为10?g； 上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入加样孔，以5V/cm的电压电泳1h～1.5h； 待溴酚蓝迁移至凝胶长度的4/5处结束电泳。将凝胶置于溴化乙锭溶液中染色约30min； 在紫外灯下观察结果(如果用于Northern blot ,在凝胶转膜前应做好移动距离的标记)。 步骤： * 琼脂糖凝胶甲醛变性电泳步骤： 制备凝胶(1.2％)：称1.2克琼脂糖，加72ml DEPC处理的水，加热溶化。冷却至60oC，在通风厨内加入10×凝胶缓冲液10ml， 甲醛（37％）18ml， 混均后到入凝胶模具中。 样品制备：在离心管里，将RNA样品与10×样品缓冲液以9：1比例混合。65oC温浴5－10分钟， 迅速在冰上冷浴5分钟， 瞬时离心数秒。对于Northern杂交实验，总RNA上样量可达到10-30?g。 * 上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。以5V/cm的电压电泳1.5h-2.0h。 待溴酚蓝迁移至凝胶长度2/3-4/5处结束电泳。将凝胶置于溴化乙锭溶液(0.5 ?g/mL，用0.1mol/mL乙酸胺配制)中染色30min。 在紫外灯下观察结果。 * 100mg叶子可以提到80?g （溶于50?l），点样量每个孔2-10?g。 * 实验、七 植物总RNA的提取与电泳 * 1. 实验目的和要求 掌握RNA制备以及常用鉴定方法的原理、操作步骤、注意事项和技术关键。 * 2. 相关基础知识 由于RNA是基因表达过程中非常重要的生物分子，如mRNA,它携带了DNA的全部编码信息。RNA的分离是研究基因功能的重要基础之一，在分子生物学中占有重要的地位。提取的mRNA可用于Northern blot、RT-PCR、构建 cDNA文库、Gene Chips以及体外翻译等实验。 * 由于RNase极稳定，所以，在操作RNA时，要格外仔细，以防RNA被降解。在提取RNA之前，必须对所用器皿进行RNase灭活处理。如用180oC干烤8小时以上处理玻璃器皿，或用0.1?的焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡玻璃器皿和其它用品。所用水以及相关的缓冲液也需要用0.1? DEPC水处理，但Tris-Cl缓冲液等不可以用DEPC处理。 注意：DEPC有致癌之嫌 ，必须小心操作，防止接触与吸入 ！ * 植物细胞内的RNA主要是 rRNA（占80～85％）、tRNA及小分子RNA（占10～15％）和 mRNA（占1～5％）。rRNA含量最丰富，由25S、18S和5S几类组成。mRNA种类繁多，分子量从数百至数千碱基不等，但绝大多数mRNA在3’端都有一个polyA尾巴，因此，可根据此特性用寡聚脱氧胸苷(OligodT)层析柱从总RNA中将 mRNA分离出来。一般情况下，提取的总RNA也可用于Northern blot试验。 * * 提取植物RNA时，要注意的问题： 1）一般用机械研磨的方法破碎植物 组织细胞； 2）要加入蛋白质变性剂，使核蛋白 与RNA分离并释放出RNA； 3）抑制内源和外源RNase活性； 4）将RNA与DNA、蛋白质及其它细 胞成分分开。 * 苯酚法：用SDS变性蛋白并抑制RNase活性，经多次酚/氯仿抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用NaAC和乙醇沉淀RNA； 胍盐法：用异硫氰酸胍或盐酸胍和?-巯基乙醇变性蛋白，并抑制RNase的活性，经酚氯仿抽提后再沉淀； 氯化锂沉淀法：因为锂在在一定pH下能使RNA相对特异地沉淀，但容易使小分子RNA损失，而且残留的锂离子对mRNA有抑制作用。 已有多种较为成熟的分离总RNA的方法，常用的有3种: * 本实验采用QIAGEN试剂盒，其原理是依据胍盐法。即在含有强的异硫氰酸胍变性剂的提取液中裂解植物组织粉末，在提取缓冲液中含有RNase抑制剂，抑制RNase活性，保证RNA的完整性。通过第一次离心柱时细胞碎片被阻留在柱子上，溶液均质化，包括RNA在内的分子物质通过离心柱。加入乙醇后，再过第二个离心柱，RN A就结合在柱子底部有硅胶的膜上，洗去其它杂质，最后用无RNase的水溶出RNA。该柱子可结合100?g大于200bp的RNA，所以应控制起始材料的用量。 * RNA的检测： RNA的检测主要用琼脂糖凝胶电泳，分为非变性电泳和变性电泳。一般变性电泳用的最多