12基因工程的基本操作程序(新)XXXX(2).pptxVIP

1、结合图，判断下列有关基因工程的工具酶功能的叙述，正确的是 (　　)。A．切断a处的酶为限制性核酸内切酶B．连接a处的酶为DNA聚合酶C．切断b处的酶为限制性核酸内切酶D．切断c处的为限制性核酸内切酶ADNA连接酶DNA水解酶c2021/7/41.2 基因工程的基本操作程序2021/7/4 基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取二、基因表达载体的构建三、将目的基因导入受体细胞四、目的基因的检测与鉴定2021/7/4一、目的基因的获取1、目的基因:主要是编码蛋白质的结构基因2、获取方法：1）从基因文库中获取目的基因2021/7/41）从基因文库中获取目的基因：⑴基因文库: 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(gene library)⑵分类：①基因组文库:包含了一种生物所有的基因的基因文库。构建方法：限制酶切法②部分基因文库（如cDNA文库):包含了一种生物的一部分基因的基因文库。构建方法：逆转录法2021/7/4　用限制酶切断成许多片段限制酶切法（鸟枪法或散弹射击法） 2021/7/4反转录限制酶与运载体连接 导入与运载体连接 导入1、从基因文库中获取目的基因某种生物某个时期的mRNA某生物体内全部DNA 许多DNA片段cDNA受体菌群体受体菌群体部分基因文库（cDNA文库）基因组文库2021/7/4非编码区非编码区编码区与RNA聚合酶结合位点非编码区编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点原核生物基因真核生物基因外显子内含子2021/7/4非编码区非编码区编码区A G G U C A C G U C G多 肽 链一个典型的原核细胞基因结构示意图T C TA G G T C A C G T C GT C C A G TA G AT C C A G T G C A G CA G G T C ARNA聚合酶mRNA2021/7/4翻译肽链一个典型的真核细胞基因结构示意图非编码区非编码区编码区编码区下游与RNA聚合酶结合位点12345内含子外显子转录mRNA前体加工成熟mRNA2021/7/4一、目的基因的获取1、目的基因:主要是编码蛋白质的结构基因2、获取方法：1）从基因文库中获取目的基因2）利用PCR技术扩增目的基因2021/7/42、利用PCR技术扩增目的基因① 概念： 聚合酶链式反应，在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基因。DNA复制②原理：__________模板DNA③条件：_______________________、 _______________、___________ (做启动子)、 _______ ____.四种脱氧核苷酸一对引物热稳定DNA聚合酶2021/7/4利用PCR技术扩增2021/7/4变性延伸退火循环2021/7/4利用PCR技术扩增目的基因④过程： ①：加热至90～95℃，使DNA解旋；②：冷却到55～60℃，2个引物分别与DNA单链结合；③：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶开始互补链的合成。 氢键断裂2n指数⑤方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循 环的次数）⑥结果：使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增2021/7/4与体内DNA复制的区别：①：不需要解旋酶；②：需加入引物 （前提：已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物） ③：需热稳定DNA聚合酶( Taq酶)；与体内DNA复制的相同点：(1)模板：均需要脱氧核苷酸双链作为模板(2)原料：均为四种脱氧核苷酸(3)酶：均需DNA聚合酶(4)引物：都需要引物，使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸2021/7/4一、目的基因的获取1、目的基因:主要是编码蛋白质的结构基因2、获取方法：1）从基因文库中获取目的基因2）利用PCR技术扩增目的基因3）化学方法人工合成——DNA合成仪2021/7/43、 人工合成法 在基因较小，核苷酸序列已知的前提下，可以利用DNA合成仪人工合成蛋白质的氨基酸序列推测思考：化学法合成的目的基因含内含子、启动子和终止子吗？mRNA的核苷酸序列推测基因的核苷酸序列化学合成目的基因2021/7/4使目的基因在受体细胞内稳定存在，并且可以遗传给下一代，（P11）同时使目的基因能够表达和发挥作用。-----------核心二.基因表达载体的构建1、载体构建目的：2、基因表达载体的组成启动子+目的基因+终止子+标记基因2021/7/4表达载体启动子：终止子：首端①位置:DNA②本质:有与RNA聚合酶结合的位点，能驱动转录③功能:尾端①位置:②本质:能终止转录2021/7/43、基因表达载体的构建过程特别提醒　该过程把三种工具(两种工具酶、