常用的分子生物学内容和相关技术.docxVIP

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2021-11-19 发布于河北
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— PAGE \* Arabic 1 — 常用的分子生物学内容和相关技术常用的分子生物学内容和相关技术一、分子克隆（分子操作）大肠杆菌中1．原核表达系统（PET28a，PET30a 等）融合蛋白抗原免疫动物原核表达系统蛋白转导系统（TAT）大肠杆菌中 2．真核表达系统（pcDNA3）：用于transfection（基因转染）在培养的动物细胞中分子克隆的方法： ●选择合适的表达载体 ●选择酶切位点，设计PCR引物并合成 ●制备待克隆的靶基因 ?PCR（来源培养细胞或组织、植物的mRNA cDNA） ?RT-PCR ?质粒中已克隆的目的片段 ?人工合成cDNA片段退火后形成双链二、细胞培养 ?动物细胞 ?植物细胞 ?原代细胞培养 ?传代细胞培养三、探讨功能：与细胞生长、增殖、凋亡的关系，检测mRNA、蛋白质的表达变化及意义 ?内源基因：或使内源基因表达抑制（RNAi, down-regulation）或缺失、突变 ?外源基因：通过transfection（基因转染）、电转移、显微微注射等方法将外源基因导入培养的细胞中过表达（overexpression），在mRNA、蛋白质水平上表达上调（up-regulation） ?信号传导：protein-protein interaction ◆Two hybrid system ◆Western blot ◆免疫荧光双标记图像分析 ?细胞:BrdU,Flow Cytometry（cell cycle，apoptosis） ?动物：成瘤四、检测表达 ?DNA:Reporter gene(promoter activity),Hybridization （DNA-Southern blot，RNA-Northern blot，tissues or cells-in situ） ?RNA:RT-PCR，Real-time PCR,microRNA Gene chips:cDNA,microRNAs ?Proteins （tissues or cells-Western blot or immunohistochemistry，serum or conditional medium–ELISA）