活体动物体内成像技术.pptxVIP

1;主要采用生物发光与荧光两种技术;　　　　　技术优势;●传统的动物实验方法需要在不同的时间点宰杀实验动物以获得数据, 得到多个时间点的实验结果。 ●可见光体内成像通过对同一组实验对象在不同时间点进行记录，跟踪同一观察目标 （标记细胞及基因）的移动及变化，所得的数据更加真实可信。;●这一技术对肿瘤微小转移灶的检测灵敏度极高，不涉及放射性物质和方法, 非常安全。 ●因其操作极其简单、所得结果直观、灵敏度高等特点, 在刚刚发展起来的几年时间内，已广泛应用于生命科学、医学研究及 　药物开发等方面。;1. 标记原理;生物发光成像系统组成;精诺真（Xenogen）活体化学发光和荧光成像系统;Lightools活体荧光成像系统;标记细胞的方法:通过分子生物学克隆技术, 将荧光素酶的基因插到预期观察的细胞的染 色体内，通过单克隆细胞技术的筛选, 培养 出能稳定表达荧光素酶的细胞株。 结果观察：将标记好的细胞注入小鼠体内后, 观测前需要注射荧光素酶的底物—荧光素， 为约280道尔顿的小分子。注射一次荧光素能 保持小鼠体内荧光素酶标记的细胞发光30-45 分钟。应用一个高度灵敏的制冷CCD相机及特 别设计的成像暗箱和成像软件。;2. 光学原理;3. 实验过程 ;典型的成像过程;4．荧光成像功能;●荧光信号远远强于生物发光，但非特异性荧光产生的背景噪音使其信噪比远远低于生物发光。这些背景噪音造成荧光成像的灵敏度较低。 ●荧光成像有其方便，便宜，直观，标记靶点多样和易于被大多数研究人员接受的优点，在一些植物分子生物学研究和观察小分子体内代谢方面也得到应用。;●最近许多文献报道，利用绿色荧光蛋白和荧光素酶对细胞或动物进行双重标记，用成熟的荧光成像技术进行体外检测，进行分子生物学和细胞生物学研究；然后利用生物发光技术进行动物体内检测，进行活 　体动物体内研究。 ;技术应用 ;1. 标记细胞;;（2） 免疫学与干细胞研究;（3） 细胞凋亡;2. 标记病毒;用RFP标记病毒，动态检测病毒在体内的复制过程。例：In vivo Near-Infrared Fluorescence Imaging of Integrin _v_3 in BrainTumor Xenografts;（2） 基因治疗;;3. 标记细菌;4. 基因表达和蛋白质相互作用;（2） 蛋白质相互作用;（3） 阻断RNA;5. 转基因动物模型;（2） 各种疾病模型; 活体动物体内成像技术常见问题 ;关于细胞标记和荧光素酶的特性;;3. 底物荧光素(Luciferin)是如何进入小鼠体内的？需要多少？ 荧光素是腹腔注射或尾部静脉注射进入小鼠体内的，约一分钟就可以扩散到小鼠全身。 大部分发表的文章中，荧光素的浓度是150mg/kg (见下图)。20克的小鼠需要3毫克的荧光素，价钱约两到三美元。常用方法是腹腔注射，扩散较慢，开始发光慢，持续发光长。若进行荧光素静脉注射，扩散快，开始发光快，但发光持续时间很短。 4. 荧光素的体内代谢过程 不同品牌的荧光素底物的代谢过程不太一样， 使用前最好做一些体外试验，做一个标准曲线。;第35页/共87页;5. 两次观察间隔时间最短为多长时间？ 观察时间的间隔没有最短限制， 只要观察的条件控制一致就可以。虽然底物在动物体内有一定的代谢过程，但是上一次底物的残留曲线可以知道，可以控制对下一次观察结果的影响。 6. 荧光素酶基因，荧光素酶，荧光素底物有多大？可以透过血脑屏障吗？ 荧光素酶有554个氨基酸，约50KD。荧光素酶的底物荧光素，约280道尔顿。荧光素的水溶性和脂溶性都非常好, 很容易穿透细胞膜和血脑屏障。 ;7. 做体内实验的luciferin 与体外实验的是不是一样，如何购买？最小包装多大？ 体内生物发光是用的是D-Luciferin，有1g或小到100mg 的包装。 8. 如何保证荧光素酶(Luciferase)的稳定性？ 荧光素酶基因是插到细胞染色体内的，当细胞分裂、转移、分化时, 荧光酶也会得到持续稳定的表达。荧光素酶的半衰期约三个小时, 所以只有活细胞才能够持续表达荧光素酶。;9. 标记的肿瘤接种以后，会发生luciferase的丢失吗？ 没有正式的报道丢失Luciferase的情况。丢失的可能性及量非常小，不会影响实验结果。一些实验报道的结果中，标记的细胞在动物体内存活几年的时间还可以持续发光，说明Luciferase基因的标记非常稳定。 10. 在in vitro 的细胞培养中，为什么要经常用抗生素筛选？ 荧光素酶基因标记的细胞株是经过单克隆筛选培养过的稳定的细胞株。体外培养过程中，不筛选也可以，只要时间不是很长， 接种代数不要很多。到目前为止，还没有发现基因丢失的情况。但若接种的代数过多，建议用药物筛选