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聚合酶链式反应（ PCR） 聚合酶链式反应（ Polymerase Chain Reaction ，PCR）是体外酶促合成特异 DNA片段的一种 方法，为最常用的分子生物学技术之一。典型的 PCR由（ 1）高温变性模板； （2 ）引物与模 板退火；（ 3 ）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的 DNA得 以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板 DNA置高温下（通常为 93℃-94 ℃）使其变性 解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条 单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的 DNA聚合酶 （Taq 酶）在 72℃将单核苷酸从引物的 3 ’端开始掺入，以目的基因为模板从 5 ’→3’方向 延伸，合成 DNA的新互补链。 PCR 能快速特异扩增任何已知目的基因或 DNA片段， 并能轻易在皮克 （pg ）水平起始 DNA 混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性 DNA片段。因此， PCR技术一经 问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。 它不仅可以用于基因的分离、 克隆和核 苷酸序列分析， 还可以用于突变体和重组体的构建， 基因表达调控的研究， 基因多态性的分 析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。通常， PCR在分子克 隆和 DNA分析中有着以下多种用途： (1) 生成双链 DNA中的特异序列作为探针； (2) 由少量 mRNA生成 cDNA 文库； (3) 从 cDNA中克隆某些基因； (4) 生成大量 DNA以进行序列测定； (5) 突变的分析； (6) 染色体步移； (7) RAPD、AFLP、RFLP等 DNA多态性分析等。 一、试剂准备 1. DNA 模版 2．对应目的基因的特异引物 3．10×PCR Buffer 4 ．2mM dNTPmix：含 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各 2mM 5．Taq 酶 二、操作步骤 1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌 0.5ml 离心管中。 10 ×PCR buffer 5 μl dNTP mix （2mM） 4 μl 引物 1 （10pM） 2 μl 引物 2 （10pM） 2 μl Taq 酶 （2U/ μl ） 1 μl DNA 模板（ 50ng-1 μg/ μl ） 1 μl 加 ddH2O至 50 μl 视 PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。 2． 调整好反应程序。 将上述混合液稍加离心， 立即置 PCR仪上，执行扩增。一般： 在 93 ℃ 预变性 3-5min ，进入循环扩增阶段： 93℃ 40s → 58 ℃ 30s → 72 ℃ 60s ，循环 30-35 次， 最后在 72℃ 保温 7min 。 3． 结束反应， PCR产物放置于 4 ℃待电泳检测或 -20 ℃长期保存。 4 ．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用 100 μl 氯仿进行抽提反应混合液，以 除去石蜡油；否则，直接取 5-10 μl 电泳检测。 三、 PCR反应体系的组成与反应条件的优化 PCR 反应体系由