翼齿六棱菊5β-olide分离纯化及生物学活性评价.docxVIP

翼齿六棱菊 5β -olide 分离纯化及生物学活性评价 天然抗肿瘤药物是抗癌药物的一个重要分支 , 在临床抗癌治疗中占有极其重 要的地位。本研究选择具有清热消炎止咳作用 , 以及抗肿瘤潜力的中药——翼齿 六棱菊为研究对象 , 分离纯化所含的小分子化合物 , 从中筛选具有促进肿瘤细胞 凋亡、抑制肿瘤细胞生长活性的物质 , 并探讨其体外抗肿瘤作用的活性 , 为寻找高 效、靶标独特的抗肿瘤新药提供研究基础。 取得了以下结果。 1、应用硅胶、凝胶、高效液相等多种色谱分离技术 , 从翼 齿六棱菊中分离到 7 个候选化合物 , 包括 4 个黄酮和 3 个倍半萜 ; 经 NMR,MS等方 法检测 , 分别鉴定为 5β -olide 、Isocostic acid 、 3H-Naphth[1,8a-b]oxirene-7-acetic acid 、 Artemetin 、 3,6,7,4 ’ -Tetra-O-methyl-5,3 ’-dihydroxyflavone 、 5-hydroxy-2- 4-hydroxy-3-methoxyphenyl ）-3,6,7-trimethoxy-4H-chromen-4-one、 4’,5-Dihydroxyflavone 。 2、采用 MTT（3- （ 4,5-dimethyl-2-thiazolyl ） -2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide ）法评价翼齿六棱菊中分离到的上述 7 个化合物的体外抗肿瘤活性 , 浓度 40μM时抑制率分别为 90%、11.3%、4%、9.7%、 16.1%、0%、2.9%, 结果表明 5β-olide 抑癌活性最好。3、采用 MTT法将 5β -olide SMMC 7721、SW480、 MDA-MB-231、 T47D和 Hela 这 5 株肿瘤细胞进行 ICsub50/sub 测定 , 其 ICsub50/sub 分别为 3.36mM/L、 4.04mM/L、 11.8mM/L、10.57mM/L、14.31mM/L。 4、通过检测 5β -olide 处理后 SMMC7721、SW480的生长曲线 , 发现 5β -olide 浓度≥ 2mM,处理 24h, 开始出现细胞增殖的抑制活性。 5、应用荧光显微镜观察 SMMC 7721细胞核形态的变化 ;8mM的 5β-olide 处理 SMMC 7721细胞 24 h, 细胞 核发生了明显的畸形变化 , 一些细胞核呈月牙型且皱缩边集化 , 具有典型的凋亡 形态。 采用 Hoechst/PI （ Propidium Iodide ）染色后发现 , 随着 5β-olide 浓度的 加大和作用时间的延长 , 亮蓝色的细胞增多 , 表明细胞凋亡增加。 6、应用 DCFH-DA （ 2’ ,7 ’-Dichlorodihydrofluorescein diacetate ）方法检测 5β-olide 对 SMMC7721内源活性氧的影响 ; 通过 ROS（reactive oxygen species ）清除试验检 测细胞凋亡是否与 ROS有关 ; 结果表明 ,Hsub2/subOsub2/sub组及 8mM5 β -olide 处理组诱导明亮的绿色荧光产生 , 说明此时 ROS大量生成 ; 当加入 NAC （ N-acetyl-L-cysteine ）清除 ROS之后 ,5 β-olide 对 SMMC7721 的细胞毒性显 著降低 , 说明 5β -olide 是通过触发 ROS过度产生引起 SMMC7721凋亡。 7、通过检测 JC-1（5,5 ′ ,6,6 ′ -Tetrachloro-1,1 ′,3,3 ′-tetraethyl imidacarbocyanine iodide ）, 观察 5β-olide 对 SMMC 7721线粒体膜电位的影 响 ; 使用 Mito-tracker Red 探针标记细胞线粒体后 , 在激光共聚焦下观察 5β -olide 对细胞线粒体形态的影响 ; 研究发现 :Control 组细胞红色荧光较强 ,FCCP 组绿光较强 , 随着 5β-olide 的浓度增加 , 绿色荧光逐渐增强 ,8mM时绿色荧光较 强 ; 用 Mito-tracker Red 染料染色 , 可发现 5β-olide 处理后的细胞线粒体呈颗 粒状 , 说明 5β-olide 能降低线粒体膜电位 , 使线粒体破碎。 8、Western blot 方 法 , 观察 5β-olide 处理 SMMC 7721前后细胞线粒体凋亡通路相关蛋白的变化 ; 发现 5β-olide 处理组 Bax、Bid 上调 ,Bcl-2 下调 ,caspase 3 和 PARP