Western操作步骤分析和总结.pdfVIP

Western 操作步骤 Western-Blot 操作流程及注意事项 Western 操作步骤 （一）蛋白样品制备 （1）单层贴壁细胞总蛋白的提取： 1. 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸 干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶 底然后再用移液器将其吸走）。 2. 每瓶细胞加 3ml 4 ℃预冷的 PBS （0.01M pH7.2~7.3 ）。平放轻轻摇动 1min 洗涤细胞，然后弃去 洗液。重复以上操作两次， 共洗细胞三次以洗去培养液。 将 PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。 3. 按 1ml 裂解液加 10 μl PMSF（100mM ），摇匀 置于冰上。（ PMSF 要摇匀至无结晶时才可与裂解液混 合 ） 4. 每瓶细胞加 400 μl含 PMSF 的裂解液，冰上裂解 30min ，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 5. 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一 侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5ml 离心管中。（ 整个操作尽量在冰上进行 ） 6. 于 4℃下 12000rpm 离心 5min 。 （提前开离心机 预冷 ） 7. 将离心后的上清分装转移倒 0.5min 的离心管中 放于 -20℃保存。 （个人感觉上述方法可操作性有待加强，细胞中蛋白本 来就很少，一瓶 50ml 的细胞有时按照实验要求只能加 100~200 μl的裂解液，按照上述操作，直接用 200 μl裂 解液进行裂解，根本就不够瓶壁上沾的。本人是先用预 冷的 PBS （一般数毫升）加入后，用细胞刮刮下细胞， 转移至试管中，如果数瓶细胞是收集同一蛋白的，可以 放在同一试管，离心后再将蛋白转移到 EP 管中，这样 可操作性就比较强 ） （2 ）组织中总蛋白的提取： 1. 将少量组织块置于 1~2ml 匀浆器中球状部位， 用 干净的剪刀将组织块尽量剪碎。 2. 加 400 μ单去污剂裂解液裂l （含PMSF ）于匀浆 器中进行匀浆。然后置于冰上。 3. 几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次 使组织尽量碾碎。 4. 裂解 30 min 后，即可用移液器将裂解液移至 1.5ml 离心管中，然后在 4℃下 12000rpm 离心 5min ， 取上清分装于 0.5ml 离心管中并置于 -20℃保存。 （3）加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取： 由于受药物的影响， 一些细胞脱落下来， 所以除按 （一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液 中细胞总蛋白的提取： 1. 将培养液倒至 15ml 离心管中，于 2500rpm 离心 5min 。 2. 弃上清，加入 4ml PBS 并用枪轻吹打洗涤，然后 2500rpm 离心 5min 。弃上清后 PBS 重复洗涤一次。 3. 用枪吸干上清后，加 100 μ裂解液（含l PMSF ） 冰上裂解 30min ，裂解过程中 要经常弹一弹以使细胞充 分裂解。 4. 将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起 4℃、 12000rpm