AS中性蛋白酶生产条件的优化及活力的测定.docVIP

实验四 AS1.398 中性蛋白酶生产条件的优化及其活力的测定 一、目的 1、 熟悉微生物酶制剂的生产过程 2、 掌握酶活力的检测方法 3、 掌握确定最佳培养条件的方法 二、 原理 中性蛋白酶为水解酶的一种，可以将蛋白质水解成为氨基酸，是我国蛋白酶产量 最大的酶制剂品种，主要应用于皮革加工工业和食品工业。本实验使用枯草杆菌 AS1.398在实验室中模拟发酵生产中性蛋白酶酶制剂过程，确定以玉米粉、豆饼粉等为 碳源氮源的培养基配方等最佳产酶条件。 三、 主要仪器和材料 （1） 摇床、培养箱、冰箱、灭菌锅、超净工作台、低速离心机、 722-2000 分光光度计、 1/100 天平、水浴锅、电热炉。 ⑵ 枯草杆菌AS1.398、葡萄糖、玉米粉、豆浆、牛肉膏、蛋白胨、稀盐酸、氢氧化钠、 酪氨酸标准液（100卩g/mL, 0.2 mol/L 盐酸配制）、2%各素（用pH=7.5磷酸缓冲 液溶解）、 0.4mol/L 三氯乙酸、碳酸钠溶液（ 0.4mol/L ）、 folin- 酚试剂（ 1N）。 四、操作步骤 一）培养基的制备及灭菌 1、 液体细菌培养基：牛肉膏 0.3%，蛋白胨 1%，氯化钠 0.5%，调节 pH7.2-7.4 灭菌：115C, 30分钟。 2、 摇瓶培养基 基础培养基：KHPQ 1.0g , Na 2HPO2.O g , MgSO 4 • 7H2O 0.8g , 牛肉膏 0.7g （每 1000ml）。 碳源：玉米粉 4%，葡萄糖 2%，氮源：豆浆 3%， 4% （二）培养 1、 菌种活化：取保存枯草杆菌斜面，转接于空白斜面上， 37r培养36h。 2、 菌种一级扩大培养：取一环菌种接于装有 100ml 液体牛肉膏蛋白胨培养基的 250ml 的三角瓶中，37T培养48小时。 3、 摇瓶发酵培养：取1ml菌液分别接于A （牛肉膏蛋白胨）、B （葡萄糖2%豆浆3%、 C （葡萄糖2% 豆浆4%、D （玉米粉4%，豆浆3%、E （玉米粉4%，豆浆4% 液 体培养基中，调节培养基的 pH值为7.4，37C、240r/min培养36h。 （三、酶活力的测定： 1、 发酵液离心：1200r/min离心20min，取上清酶液 A、B、C、D E。 2、 不同培 养基 的酶活力测定 ： 样品：取5只小试管，分别加入1 mLA B、C、D E酶液（先于40C水浴中预热3 分钟），每个三角瓶中再加入1 mL酪蛋白溶液（先40C预热3分钟），摇匀，在 40°C水浴中精确反应10min，立刻加入3mL三氯醋酸，摇动，静置10min，滤纸 过滤，用小试管收集滤液，放置10mi n。 另取5只10mL具塞刻度试管，分别加入1.0mLA、B C D E过滤液、每管 再依次加入 5ml 0.4M NazCQ 1.0mL folin- 酚试剂，摇匀，40C水浴20min，冷 去卩，680nm波长比色。 空白：取5只小试管，分别加入1mLA B CD E酶液、每管再加入3mL三氯醋 酸，混合后加入1mL酪蛋白，振荡，过滤，收集滤液。 另取5只10mL具塞刻度试管，分别加入1.0mL上述过滤液，每管再依次加入 5ml 0.4M NazCO、1.0mL folin- 酚试剂，摇匀，40C水浴 20min。 3、酪氨酸标准曲线的绘制： 取8只小试管，按下表操作。绘制标准曲线，做出回归方程。 编号 1# 2# 3# 4# 5# 6# 7# 空白 标准溶液 ml 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0 0.2M HCI ml 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 1.0 0.4M Na 283ml 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 Folin 液 ml 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 40 C水浴， 20min 冷却 680nm波长比色 标准液卩g 10 20 30 40 50 60 70 OD 0.109 0.214 0.320 0.439 0.520 0.613 0.708 2 Y=0.01067+0.01013x R2=0.99767 五、结果处理 以40C、pH7.2条件下，粗酶液分解酪素每分钟产生1他酪氨酸定义为一个酶活力 单位。汇总全班数据，比较各培养基的优劣。 1 每升发酵液酶活力单位数=0D K 5 — 1000 / 10 （ K为标准曲线的斜率的倒数） =K OD 5 102 六、实验分组 每组5人，每班6组。 附表1 实验试剂 实验试剂 用量 实验试剂 用量 酪氨酸标准液（500旧/mL） 每班100mL 0.2M HCl 每组10mL  1%酪素（pH7.2磷酸缓冲溶液） 每组100mL 0.4M Na2CO3 每组100mL 三氯乙酸 每组