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植物生理学实验讲义 植物生理学实验讲义 PAGE PAGE / NUMPAGESPAGE12 植物生理学实验讲义 PAGE 本科学生综合性实验报告 光合色素的提取、理化性质分别、汲取光谱及含量的测定 学号： 134120171 姓名： 王晓莲 学院： 生命科学学院 专业、班级 13生物科学C班 实验课程名称： 植物生理学实验 教师及职称： 李忠光 开课学期： 2015至 2016 学年 下 学期 填报时间： 2016年 4 月 2 日 云南师范大学教务处编印 -1- 光合色素的提取、理化性质分别、 实验序号 实验二 实验名称 汲取光谱及含量的测定 实验时间 实验室 睿智三428 1．实验目的 1）掌握光合色素的提取方法以及认识相关的理化性质。 2）掌握光合色素的分别方法以及认识相关的汲取光谱。 3）掌握用分光光度计测定叶绿素含量的方法 2．实验原理 Ⅰ光合色素的提取与理化性质 光合色素能溶于拥有必定极性的有机溶剂，如丙酮、乙醇等。提取液中 无任何电子受体，所以能够察看荧光现象。离体叶绿素在有氧气和光照条 件下，发生光氧化作用，构造受到损坏，形成加氧叶绿素等产物。叶绿素 是一种双羧酸酯，能够发生皂化反响。叶绿素分子中 Mg2+与仆啉环联合不 稳固，能够被H+、Cu2+、Zn2+等离子所代替。 -2- Ⅱ光合色素的分别与汲取光谱 光合色素能溶于拥有必定极性的有机溶剂， 如丙酮、乙醇等。不一样光合 色素的分子量、分子构造、极性、溶解度、支持物对它们的吸附力等不一样， 因此分派系数不一样，故相互能够分开。叶绿素的卟啉环构造对光有很强的 汲取，主假如红光和蓝紫光。 Ⅲ 光合色素含量的测定 混淆液中的两个或多各组分，只需它们的光谱汲取峰不相互重叠，仍 然能够依据Lambert-Beer定律（A=kLC）求出各组分含量。Lambert定律：A=kL；Beer定律A=kC。叶绿素a、b在80%丙酮溶液中的Amax 分别为663nm、645nm，由此得出：见推导过程 Ca=A 663 –A 645 ； Cb=A 645 –A 663 C =A 663 +A 645 a+b A663 =Ca.ka1+Cb.kb1 A645 =Cb.kb2+Ca.ka2 因为K是一个常数，而 A能够经过分光光度计测出，故求二元一次方 程组可获得此公式。 k——比汲取系数。即溶剂和波长不变的状况下，当物质的浓度 (C)为 1g/L(0.1%)，比色皿的直径(光径，L)为1cm时所测出的吸光度即为比汲取 L 系数。故其单位为： ε——摩尔汲取系数。即溶剂和波长不变的状况下，当物质的浓度(C)为1mol/L，比色皿的直径(光径，L)为1cm时所测出的吸光度即为摩尔吸 -3- 收系数。故其单位为： 3．实验设施及资料  L （1）资料 鲜植物叶片、丙酮、碳酸钙、石英砂、 20%KOH甲醇溶液、苯、 新 自来水、50%醋酸、醋酸铜、启动剂、 80%丙酮 2）实验设施 试管、滤纸、研钵、玻璃棒、锥形瓶、剪刀、移液管、洗耳球、烧杯、漏斗、离心计、便携式叶绿素测定仪、分光光度计、天平、离心管、滴管 4．实验步骤 Ⅰ光合色素的提取与理化性质 1）光合色素的提取：将植物叶片洗净并用滤纸洗干，取1/2片叶片，放入研钵中并加入少量CaCO3和石英砂及5ml丙酮，充足研磨，再加入10ml丙酮，研磨，静止片晌，上清液过滤于三角瓶中，待用。 2）察看荧光现象：与光芒垂直的方向察看色素颜色。 3）光损坏作用：1ml色素提取液于室内，1ml于太阳光下，30min后观 察颜色变化。 （4）皂化反响：取一支试管，加入色素提取液 ，再加入 20%KOH -4- 甲醇溶液1ml，摇匀，再加入苯，轻轻摇动，沿试管壁慢慢加入自来水1ml，轻轻摇动后察看，注意察看整个过程颜色的变化。 （5）代替反响：取一支试管，加入3ml色素，逐滴加入50%醋酸直至溶液变为黄褐色。倒出一半，加入少量醋酸铜粉末，酒精灯上加热，与另一 半比较颜色的差异。 光合色素的分别与汲取光谱 1）光合色素的提取：将植物叶片洗净并用滤纸洗干，取1/3片叶片，放入研钵中并加入少量CaCO3和石英砂及5ml丙酮，充足研磨，再加入10ml丙酮，研磨，静止片晌，上清液过滤于三角瓶中，待用。 2）光合色素分别：剪取适合长度和宽度的滤纸条→用上行纸层析法分别色素→启动剂：石油醚：丙酮：苯=10：2：1 3）汲取光谱的测定 光合色素的汲取光谱：取色素溶液1mL，加入丙酮3mL，摇匀后在分光光度计上400到700nm处每隔10nm进行扫描。 各色素的汲取光谱：上述层析出的3~4种色素，分别剪下后溶于3mL丙酮中，按上述方法扫描。 光合色素含量的测定方法一：迅速测定法 因为叶绿素a、b在652nm处有共同汲取，k=Lg-1.cm-1。可直接用便携式叶绿素测定