流式细胞术白婷婷.pptxVIP

1;技术基本原理 目前进展 方法步骤 应用实例;概念： 流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的高新技术。 ;1.流动室和液流系统 （流动室和液流驱动系统） 2.光学系统 （激光光源和光束形成、收集系统） 3.数据处理系统 ;;;; 散射光 ;中性粒细胞;工作原理  将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。 　 流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测， 这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。 　　这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过 A／D转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示 在计算机屏幕上，也可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。 ;第10页/共38页; 速度快 高灵敏度 高精度 高纯度 多参数 在适当的条件下，可以对细胞进行无害性的分析和分选; 目前进展： （1）仪器构造 （2）技术方法 从相对细胞计数到绝对细胞计数 检测参数从相对定量发展为绝对定量分析 从单一信息的检测到多种信息的同时检测 从细胞膜成分到细胞内成分分析 从细胞特征分析到液态成分分析 从蛋白质表型分析到电子表型分析 从非配套试剂发展为配套试剂盒;方法步骤：; 新鲜实体组织： （一）酶消化法 胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原酶等。 （影响化学成分） （二）机械法：剪碎法、网搓法、研磨法。 （损伤大，单细胞产率低） （三）化学试剂处理法：EDTA 将细胞间起粘连作用的钙、镁离子置换出来。 （细胞存活率低） ; 1.将适合于酶消化的组织置于离心管中。 2.将选好的酶溶液1~2ml加入盛有被消化组织的试管中。 3.常规消化20~30分钟（恒温370C或室温） ，消化期间间断震荡或吹打。 4.终止消化，收集细胞悬液，以300目尼龙网过滤，除去细胞团块，以低速离心除去细胞 碎片。;用于免疫表型分析的抗体主要是IgG类单克隆抗体，一般为IgG1、 IgG2a、 IgG2b, IgM型很少。;;荧光染料与细胞成分的结合方式： 结构亲和方式 嵌入结合方式 共价结合方式 荧光抗体特异性结合方式 1、直接免疫荧光染色 2、间接免疫荧光染色;;对照的设置;;数据显示方法;X轴表示荧光信号强弱,Y轴则反应细胞的数量.; 纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量 参数,在图中每一个点代表一个细胞; 用等高线来表示细胞数，在一条等高线上细胞数相 同，不同的等高线上细胞数不同。;;; 设门（gating），就是划定某一区域的细胞群体，对其单独加以分析和分选。;数据采集与分析方法;一、淋巴细胞及其亚群的分析 ;一、淋巴细胞的免疫表型分析 二、细胞因子的检测; 样品采集与处理： 采集空腹静脉血，用EDTA或肝素抗凝。血量至少1ml，样本采集6小时，冷冻的标本以及溶血样本不能用。 样本制备： 1.按照试剂使用说明书的要求，分别向已编好号的试管中加入建议体积量单克隆抗体和同型对照。 2.分别向试管中加入混合的100ul抗凝血 3.混匀，避光，室温孵育20-30分钟。 4.溶血：加入溶血剂后充分混匀，避光，置室温，直到试管透明。 5.离心弃上清，加入固定液500ml。 6.上机测样。 ; 细胞因子 是可溶性蛋白，在淋巴细胞应答中有重要的免疫作用。但是在通常情况下，未刺激的淋巴细胞不表达或表达量极微无法检测，故必须有活化过程。 （1）材料和试剂 ①主要抗体 ②其他试剂 （2）样本制备 ①细胞培养 ②实验分组 ③表面抗原及细胞因子染色 （3）上机