第20章重组DNA技术.pptxVIP

第 二十 章;第 一 节 重组DNA技术的基本过程;重组DNA技术：又称DNA克隆或基因克隆 应用酶学的方法，在体外将不同来源的特异基因或DNA片段插入病毒、质粒或其它载体分子，构建重组DNA分子，然后将重组DNA导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖（称之为“克隆”），筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子。;克隆(clone)：来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 克隆化(cloning)：获取这类同一的DNA分子群体、细胞群体或个体群体的过程，即无性繁殖。 重组DNA(recombinant DNA,或嵌合DNA, chimera DNA)：采用克隆技术，把来自不同生物的外源DNA插入载体分子所形成的杂合DNA分子。;重组DNA技术的基本过程 ;第二节 重组DNA技术中常用工具酶 ; ;作用： 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。;第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。;Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构 (palindrome) ; ; ; ;同裂酶 来源不同但能识别相同序列的酶，又称同功异源酶。;同尾酶 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的黏性末端，称为同尾酶。这两个相同的黏性末端称为配伍未端(compatible end)。; 可变酶 识别DNA序列中的一个或几个碱基是可变的，并且识别序列往往超过6个核苷酸。此类酶是Ⅱ型限制酶的特例。 如：BstpⅠ G GTNACC; Bbl Ⅰ GCC(N)4NGGC;2. DNA连接酶 (DNA ligase) —基因工程的缝纫针; 也可将双链DNA分子内部的单个切口(无核苷酸空缺)连接起来。还可作用于RNA，但效率很低。;DNA连接酶; ; 能够把脱氧核糖核苷酸连续地添加到双链DNA分子引物链的3′-OH末端，催化核苷酸的聚合作用 类型： 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段 Taq DNA聚合酶 反转录酶 ;四、其它修饰酶 ; ; ; ;重组DNA技术中常用的工具酶; 目的基因进入原核或真核细胞并高效复制和表达蛋白质，需要装入载体才能实现。 载体（vector） 指能携带外源DNA分子进入受体细胞 进行扩增和表达的运载工具; 作为基因工程载体所需具备的基本条件;克隆载体 (cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体。; ;1. 质粒 (plasmid)载体; ;pUC18/pUC19; 2. 噬菌体 (phage)载体;3. 人工染色体载体 ;4. 病毒载体 ;第四节 目的基因的获得和体外重组 ;目的基因 (target DNA);（一） 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产 物的氨基酸序列 （二）聚合酶链反应 (polymerase chain reaction, PCR) （三）从基因文库中筛选;* 化学合成法获取目的基因;组织或细胞染色体DNA;;mRNA ; ;（三）外源基因与载体的连接—接;Bam HⅠ切割反应;不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接;2. 平末端连接 适用于：限制性内切酶切割产生的粘端补齐或切平形成的平端;目的基因;3. 人工接头(linker)连接 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生黏性末端，而进行粘端连接。 ;人工接头及其应用;4. 同聚物加尾连接 在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出黏性末端，再进行粘端连接。;5′ 3′;5. T-A克隆 是直接将PCR产物插入到载体中的方法。;第五节 重组分子的导入和筛选与鉴定;一、重组DNA分子的导入;导入方式 转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染 (infection);非转化子; 直接选择法 抗药性标记选择 标志补救 (marker rescue) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹 免疫学方法 如免疫化学方法及酶免检测分析等; ; ; ;重