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PAGE PAGE 1 PCR检测技术（二） (三)PCR反应参数 在PCR反应中每轮循环的各步反应时光不应过长，以免降低TagDNA聚合酶的活力。下面介绍PCR反应中的一些详细参数。1.变性在第一轮扩增前使DNA彻低变性非常重要，因此普通反应中都先在94℃变性5 min，然后再加入TagDNA聚合酶举行扩增。变性不彻低往往使PCR反应失败，由于未彻低变性的DNA会很快复性，削减DNA的产量。DNA变性普通仅需要几秒钟即可完成，反应中变性所需的时光主要是为使囫囵反应体系达到合适的变性温度。变性时温度过高或时光过长，都会导致酶活力的降低。TagDNA聚合酶活力的半衰期为：92.5℃,130min; 95℃, 40min;97℃，5min。典型的变性温度和时光为94℃，1 min或97℃，15s。2．退火引物退火温度和所需时光长短取决于引物的碱基组成、引物的长度、引物与模板的匹配程度以及引物的浓度。实际用法的退火温度比扩增引物的Tm值约低5℃。普通当引物中GC含量较高，长度较长并且与模板彻低匹配，则应提高退火温度。退火温度越高，所得产物的特异性也越高。有些反应甚至将退火和延长反应合并，只用两种温度完成囫囵扩增循环(例如用60℃和94℃)，这既节约了时光，又提高了特异性。在典型的引物浓度(0.2mol/L)下，因为引物过量，退火仅需数秒钟即可完成。反应中所需的退火时光主要是为了使囫囵反应体系达到合适的温度。典型的退火温度和时光为50℃和2min。3．延长延长反应通常在72℃下举行，临近TagDNA聚合酶的最适反应温度75℃，事实上引物延长在退火时已经开头，由于TagDNA聚合酶的作用温度范围为20～85℃，延长反应时光的长短取决于目的序列的浓度和长度。在普通反应体系中TagDNA聚合酶每分钟可合成1kb长的DNA。对于极长的片段延长时光可达15min，但用法更长的时光则对扩增产物已没有影响。在能完成DNA合成的前提下应尽量缩短延长反应的时光以削减TagDNA聚合酶活力的降低。典型延长反应的温度和时光为72℃和1～3 min。普通在扩增反应完成后都需要有一步长时光(通常为10～30min)的延长反应，以获得尽可能完整的扩增产物，这对以后举行克隆和扩增产物测序极为重要。4．循环次数当其他参数确定之后循环次数主要取决于模板DNA的浓度，普通而言25～30轮循环已经足够。循环次数过多，会使PCR产物严峻出错，非特异性产物大量增强。普通经25～30轮循环后，DNA聚合酶已经严峻不足，不能举行扩增，假如此时产物产量还不够，需要进一步扩增，则可将扩增的DNA样品稀释103～105，倍作为模板，重新加人各种反应底物举行扩增反应。这样经60轮循环，扩增水平可达109～1010，但要注重此时非特异性产物的量也会大量增强。不同起始目的DNA分子数与所用的PCR循环次数的关系如表5-7所示。表5-7 起始目的DNA分子数与所用的PCR循环次数的关系在扩增反应后期合成产物的量达0.3～1 pmol时，因为产物堆积使本来以指数扩增的反应变成平坦的曲线，产物不再随循环次数而显然升高，这称为平台效应。平台效应取决于下列因素：①尚可利用的底物浓度(dNTP或引物浓度)；②反应中存在的酶活力；③终于产物的反馈抑制(焦磷酸或双链DNA) ;④非特异性产物或引物二聚体与反应模板的竞争；⑤在高浓度产物下产物的变性和链分别不能彻低，或者大量特异性产物重新退火(从而降低有效的模板数或者使延长反应出错)；另外平台期会浮现原先因为错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增达到较高水平。因此适当调整循环次数，在平台期前结束反应，削减非特异性产物浮现。现在有一种PCR只需10多分钟即可完成20轮循环，它利用热传递很快的毛细管，削减了反应中为使囫囵反应体系达到合适温度所需要的时光，从而提高反应效率。(四)常见PCR种类1．热启动PCR原理和特点：在传统PCR反应中除一种主要反应试剂(dNTP或TagDNA聚合酶或引物外)，其他反应成分一次性加入，当程序性升温达到70℃以上时再将反应管放在PCR扩增仪上举行扩增，这样既可以削减非特异性扩增产物的浮现，又可以削减引物二聚体的形成。2．一步单管PCR该办法主要用于RNA病毒等的检测，一种办法是首先用化学办法提取核酸，接下来将cDNA及PCR反应放在一个反应管中，在PCR扩增仪上一步举行。近年来又有入将热裂说明放核酸办法用于提取病毒RNA提取，使RNA的提取、反转录和PCR在一个反应管中一步举行，这样既削减了操作步骤，又最大限度地削减了环境核酸和核酸酶造成的污染，使特异性及敏感性都有所增强。3．多重PCR多重PCR原理与常规PCR相同，只是在反应体系中加入一对以上的特异性引物，假如存