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限制性内切酶酶切位点保护碱基 限制性内切酶酶切位点保护碱基 PAGE 限制性内切酶酶切位点保护碱基 寡核苷酸近末端位点的酶切 (CleavageClosetotheEndofDNAFragments(oligonucleotides)) 为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。 实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记单位的寡核苷酸。取1μg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液含70 mMTris-HCl,10 mMMgCl2,5 mMDTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。 本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。 DNA合成，新链的延伸方向是5→3因此，需要在5端加上酶切位点,因为内切酶除了有特异的识别位点之外，还需多几个无需特异性的碱基提供一个platform让它可以结合上去，否则会掉下来.引物的结构就是（5→3）：保护碱基+酶切位点+原来的引物序列 首先要看目的基因中是否含有该酶切位点，只有没有的才可以选(小虾米酶切位点分析)。其次，如果需要做表达，需要考虑起始密码子，防止移码突变 酶 寡核苷酸序列 链长 切割率% 2hr 20hr AccI GGTCGACC CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG 8 10 12 0 0 0 0 0 0 AflIII CACATGTG CCACATGTGG CCCACATGTGGG 8 10 12 0 90 90 0 90 90 AscI GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA 8 10 12 90 90 90 90 90 90 AvaI CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA 8 10 12 50 90 90 90 90 90 BamHI CGGATCCG CGGGATCCCG CGCGGATCCGCG 8 10 12 10 90 90 25 90 90 BglII CAGATCTG GAAGATCTTC GGAAGATCTTCC 8 10 12 0 75 25 0 90 90 BssHII GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA 8 10 12 0 0 50 0 0 90 BstEII GGGT(A/T)ACCC 9 0 10 BstXI AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT 22 24 27 0 25 25 0 50 90 ClaI CATCGATG GATCGATC CCATCGATGG CCCATCGATGGG 8 8 10 12 0 0 90 50 0 0 90 50 EcoRI GGAATTCC CGGAATTCCG CCGGAATTCCGG 8 10 12 90 90 90 90 90 90 HaeIII GGGGCCCC AGCGGCCGCT TTGCGGCCGCAA 8 10 12 90 90 90 90 90 90 HindIII CAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG 8 10 12 0 0 10 0 0 75 KpnI GGGTACCC GGGGTACCCC CGGGGTACCCCG 8 10 12 0 90 90 0 90 90 MluI GACGCGTC CGACGCGTCG 8 10 0 25 0 50 NcoI CCCATGGG CATGCCATGGCATG 8 14 0 50 0 75 NdeI CCATATGG CCCATATGGG CGCCATATGGCG GGGTTTCATATGAAACCC GGAATTCCATATGGAATTCC GGGAATTCCATATGGAATTCCC 8 10 12 18 20 22 0 0 0 0 75 75 0 0 0 0 90 90 NheI GGCTAGCC CGGCTAGCCG CTAGCTAGCTAG 8 10 12 0 10 10 0 25 50 NotI TTGCGGCCGCAA ATTTGCGGCCGCTTTA AAATATGCGGCCGCTATAAA ATAAGAATGCGGCCGC