RNA-seq数据分析分析和总结.pdfVIP

RNA-Seq数据分析 从原始的数据开始，进行 reads 回帖，到拼接转录本，计算表达量，分析差异表 达，最后可视化分析结果。 TopHat 是一 个把 reads 回帖到基因组上的工具。首先用 Bowtie 把 reads 回 帖到基因组上，然后通过拼接，我们就可以在基因组上看到一些 reads 堆叠起来的 区域，称为 consensus, 这些 consensus 可能是一个真的外显子， 也有可能是几个外 显子拼在一起的，或者一些别的情况。我们知道，经典的剪切 位点一般都有 GT和 AG这样的序列标志，在 consensus 的边界和内部， TopHat 会去找这样的剪切位点， 并且得到他们可能的组合。然后对于那些没 有被 Bowtie 贴到基因组上的 reads,TopHat 会对他们建立索引， 去和这些可能的剪切位点比对，这样就把跨越剪 切位点的 reads 准确地贴到基 因组上。 一些比较重要的命令行选项。 关于插入片段长度的选项： 在 RNA-Seq中，会把 mRNA打断成小的片段， 然后对 片段长度进行 iding 筛选后拿去测序，如果选择的片段长度是 300bp，两端各测序 75bp 的 reads, 中间的插入片段长度就应该设为 150bp. 下面是设置插入片段长度的标准差，如果选择的片段长度比较集中，这个值可 以设置的小一些，反之应该设置得大一些。 -G 选项是提供哦呢一个已有的注释文件。如果你分析的基因组被注释得比较好了， 最好能够提供这个文件， 这时 TopHat 就会先把 reads 往转录组上贴，没有贴到转录组上的再往基因组上贴， 最后把结果合并起来。我们知道大多数的转录组都是比基因组小得多的，而且 junction reads 可以直接贴到转录本上，所以这样回帖的效力和准确度都可以 得到提 高。 标准的 Illumina 平台是不分链的，我们无法知道配对的 reads 哪个方向和转 录本一致，哪个和转录本反向互补。对于分链的数据，也有两 种情况，在 firststrand 这种分链方法中，第二个 read 和转录本方向一致，第一个 read 和转 录本反向互补，在另一种 fr- secondstrand 分链方法中，就刚好反过来了。所以在 分析的时候一定要弄清楚自己的数据有没有分链，是怎么分链的。 下面是一个模拟的 RNA-Seq数据集，双端测序，有两种处理，每种处理有 3 个 重复，这里 C 代表处理， R代表重复，下面用 C1R1进行演示 首先，要有参考序列 fasta 文件，也就通常说的基因组序列。 TopHat 是利用 Bowtie2 回帖 reads, 我们首先需要建立 Bowtie2 的索引文件： bowtie2-build genome.fa( 基因组文件 ) genome （注意程序和文件所在目录） 我们还需要 reads 的 fastq 文件，双端测序的数据，两个 fastq 文件分别以下 划线 1 和 2 这样的形式结尾。 在实际分析中， 需要对拿到的数据进行质量 评估和过 滤等依稀类预处理工作，这些工作都是非常重要的。需要准备注释文件，当然它不 是必须的。它可以是 GTF或者 GFF3格式的文件，对于注释得比较好 的基因组，在 UCSC可以下载。