基因工程载体质粒电子教案.ppt

; 概 述; 质粒载体;质粒的一般生物学性质;PUC质粒都属松驰型质粒。 PACYC184等质粒属严紧型质粒。 根据需要使用严紧型还是松驰型质粒,如果插入外源DNA较大,或其产量过高会产生对宿主菌新陈代谢有干扰作用时，常选用严紧型质粒。反之选用松驰型质粒。 ;2. 质粒的不相容性(incompatibility);3. 质粒的转移性;非接合型质粒的寄主细胞中同时存在一种接合型质粒，那么它们通常也是可以被转移的。这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程，叫质粒的迁移作用（mobiligation）又叫质粒的诱动。 ;带有大肠杆菌素基因的Col质粒和带有抗菌素抗性基因的R质粒既有属于接合型的，也有属于非接合型的。 如果在非接合型质粒的寄主细胞中同时存在一种接合型质粒，那么它们通常也是可以被转移的。这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程，叫质粒的迁移作用(mobilization)又叫质粒的诱动。ColE1是一种可以迁移但属于非接合型质粒。;2）F 因子;F因子是雄性决定因子，F+细胞表面可以形成一种叫做性须（pilus）的结果，它促使F+经性须进入F-细胞。F-细胞则变为F+细胞。F因子可以通过接合作用自我转移，也能够带动寄主染色体一道转移。但F因子的这种整合过程是可逆的。在一定条件下，Hfr细胞又可重新变为F+或F-细胞。 基因工程多选用非接合型质粒，主要安全角度考虑 ;人工质粒要素;大肠杆菌质粒分子的结构示意图;质粒主要包括几个组成部分;pUC 18 和pUC 19质粒图谱;质粒主要包括几个组成部分： 一、复制子（reilcator） 也就是基础复制子（basic replicon），具有原质粒同样拷贝数的最小自主复制单位。一般约2kb，含一个复制起始部位Orgin（Ori）拷贝数多少和携带有控制复制的基因信息。; 复制起始位点(replication origin site) 是富 含A, T区,双链DNA在此 解鏈出现复制叉. 紧靠 富 A, T区的侧面富G,C区,组成回文结构,是 参与复制相关因子识别和结合位点.;具备有多克隆位点（Polylink）(MCS) 有数种限制性内切酶单一识别位点。便于插入外源DNA片段，易组建重组质粒而不影响质粒复制功能 ;有多用途的辅助序列 如加入不同启动子序列，用于生产单链DNA或RNA，外源基因的大量表达。又加入COS位点，使载体能容纳更大的DNA片段等等。 ;质粒载体的选择标记： 外源DNA片段与质粒载体DNA连接，再转化入宿主菌，经培养后需筛选鉴定转化子。这就需要利用质粒载体的可选择标记。 ; 质粒载体的选择标记;常用的是抗生素抗性基因的选择标记。主要有：四环素（Ter），氨苄青霉素（Amp），氯霉素（Cm），卡那霉素（Km）。新霉素（Neo）等。如质粒对氨苄青霉素有抗生时，则写成AmPr，反之则写成AmPs，。带有抗药性质粒称为R质粒。一个质粒载体通常有二种抗生素抗性基因 ;新的质粒还带有下列标记基因，使于筛选重组体： ①HA ②Luaferase ③GFP ④便于检测的多肽 ;　　原理是具有四环素抗性的细菌对亲脂的螯合剂萎蔫酸(fusaric acid)极为敏感，因此，将外源性DNA插入到质粒载体的四环素抗性基因的酶切位点上，在含有萎蔫酸的培养基上筛选对四环素敏感的重组子，则是十分方便的方法。; 四环素抗菌机理是抑制细菌蛋白质合成，使细菌停止生长，但菌不死亡。环丝氨酸是氨基酸的类似物，在细菌的生长过程中，如加入环丝氨酸，则会参入到细菌新合成的蛋白质多肽链，使细菌死亡。所以在含有四环素培养基上，环丝氨酸只杀死Tetr 细菌。对停止生长的 Tets 菌则无致死作用。若经过环丝氨酸法多次重复处理 Tets 菌会富集，产量上可高出数倍，便于筛选重组子。 ;环丝氨酸富集法示意图; 通常用α互补现象的检查。很多质粒载体DNA都有一段(来自大肠杆菌DNA)含β半乳糖苷酶基因(LacZ)的调控序列和该酶基因氨基端146个氨基酸编码信息。并在这个编码区中加入一个多克隆酶切位点，并不破坏阅读框。而宿主菌有编码半乳糖苷酶C端部分序列，宿主菌和质粒编码片段各自基因都不完整，都没有酶活性，当质粒转化入宿主菌后就会产生具有酶活性的蛋白质，加入生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)后会形成蓝色菌落。而插入DNA的重组子则破坏了LacZ的阅读框，不能使X-gal变蓝，而产生白色菌落。这种LacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体(宿主菌)与带有完整的近操纵基因片段的β-半乳糖苷酶阴性的突变体(质粒载体)之间