门冬酰胺酶的制备与分析.docx

1 原理 重组天冬酰胺酶的制备、纯化与鉴定 赵雅嫱 黄妤璠 龙益如 王敏敏 白华山 硫酸铵分级沉淀、 硫酸铵分级沉淀、 CM-Sephadex 和 DEAE-Sepharose 离子交换层析以及亲和层析； 重组蛋白酶活力监控与本底蛋白活力测定等等。 2 实验材料 实验仪器见表 1.1 。型号和生产厂家根据实验室现有条件核定。 表 1.1 实验仪器或装置 仪器名称 型号 生产厂家 超净工作台 PCR扩增仪 恒温培养箱 超低温冰箱 本实验主要是利用基因工程手段构建 L- 天冬酰胺酶基因工程菌。 L- 天冬酰胺酶的生理作用主要体现于其抗癌抗肿瘤活性， 特别是对非霍奇金淋巴瘤和 ALL 的有很强的抑制作用， 目前适用于治疗黑色素瘤、 非何杰金病淋巴瘤等， 也可以用于治疗急性单核细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病等。 目前，我国虽已投入生产 L- 天冬酰胺酶， 但是较国外生产成本高、 菌种产酶 活性低，提取纯化工艺落后。 针对这些问题， 本实验对大肠杆菌重组 L-天冬酰胺酶的制备、纯化与鉴定进行了系统性的探究，意图改进重组 L- 天冬酰胺酶的表达，优化其纯化工艺，分析其鉴定方法与性质。 本实验主要进行了重组克隆载体和表达载体构建、 表达与鉴定的摸索； 酶蛋白的诱导表达条件分析；酶蛋白分离纯化手段的比较和选择，如蔗糖溶液提取、 台式离心机恒温摇床 涡轮振荡器高压灭菌锅蛋白电泳仪核酸电泳仪凝胶成像仪 紫外分光光度计 高效液相色谱仪 扫描型紫外分光光度 计 制冰机 超声清洗机 实验试剂和材料见表 1.2 。材质或规格以及来源根据实验需求以及实验室现有条件核定。 表 1.2 试剂和材料 试剂或材料 材质或规格 来源 E.coli 野生型菌株 CPU21009 实验室储存 pMD18-T 50ng/ μl 宝生物工程有限公司 pET-22b 50ng/ μl 宝生物工程有限公司 Nde Ⅰ 10U/μl 宝生物工程有限公司 Xho Ⅰ 10U/μl 宝生物工程有限公司 T4 DNA Ligase 350U/μl 宝生物工程有限公司 DNA纯化试剂盒 离心柱型 天根生化科技（北京）有限公司 Ni-NTA 树脂纯化试剂盒 离心柱型 天根生化科技（北京）有限公司质粒提取试剂盒 离心柱型 天根生化科技（北京）有限公司 胶回收试剂盒 离心柱型 天根生化科技（北京）有限公司 CaCl2 60mmol/L 实验室储存 PBS NaCl Taq 酶 Mix 50x 分析纯分析纯 实验室储存 (NH4) 2 S2O8 分析纯 C2H6OS 分析纯 CH4 O 分析纯 冰乙酸 分析纯 C2H6 O 分析纯 氨基丁三醇 分析纯 考马斯亮蓝 分析纯 SDS 分析纯 Nesslers 试剂 Reagent,ACS 美国 Spectrum 公司 酵母粉 分析纯 L- 天冬酰胺 分析纯 英国 OXOID公司 蛋白胨 分析纯 甘氨酸 分析纯 琼脂糖 分析纯 葡萄糖 食品级 TEMED 优级纯 溴酚蓝 分析纯 IPTG 优级纯 丙三醇 分析纯 3 3 实验思路与步骤 本实验设计从大肠杆菌野生型菌株 CPU210009 中提取总 DNA ，通过 PCR 扩增目的基因 ansB，随后对 PCR 产物进行纯化。后分别构建重组克隆载体和表 达载体，将克隆载体导入宿主中，筛选阳性克隆，再经双酶切和测序鉴定。后将 241 caggacatga acgataatgt ctggctgaca ctggcgaaaa aaattaacac cgactgcgat301 aagaccgacg gcttcgtcat tacccacggt accgacacga tggaagaaac tgcttacttc361 ctcgacctga cggtgaaatg cgacaaaccg gtggtgatgg tcggcgcaat gcgtccgtcc421 acgtctatga gcgcagacgg tccattcaac ctgtataacg cggtagtgac cgcagctgat481 aaagcctccg ccaaccgtgg cgtgctggta gtgatgaatg acaccgtgct tgatggccgt541 gacgtcacca aaaccaacac caccgacgta gcgaccttca agtctgttaa ctacggtcct601 ctgggttaca ttcacaacgg taagattgac taccagcgta ccccggcacg taagcatacc661 agcgacacgc cattcgatgt ctctaagctg aatgaactgc cgaaagtcgg cattgtttat721 aactacgcta acgcatccga t