《发酵工程》08 基因工程菌发酵.pptVIP

第八章 基因工程菌发酵 自1973年S.N.Cohen等在体外组建成有活力质粒分子后，宣告了基因工程的诞生。经过30多年的发展，基因工程技术已被广泛应用在农业、医药、食品、化工、环保等领域，并显示出无可估量的应用前景及巨大潜力。 第一节 基因工程菌构建 一、基因工程的基本知识 基因工程的基本过程是将一个目的基因DNA片段经体外操作与载体连接，并转移到受体细胞，使之扩增，表达的操作过程。 提取供体生物的目的基因 限制性内切酶分别酶解目的基因和载体，回收纯化目的基因和载体酶解片段 连接酶连接目的基因和载体，构建出一个新的重组DNA分子（重组载体） 重组载体转入受体细胞形成重组子 对含有重组DNA的细胞进行大量培养，检测外源基因是否表达 工程菌发酵、产物纯化得到目标产物。 第二节 工程菌的发酵 基因工程菌的培养技术以传统发酵培养技术为基础，又有其独特性。由于工程菌携带有外源基因，在培养过程中，要保持工程菌的稳定性，原材料的使用、工艺控制要求、设备要求都有较大的差异。 1. 基因工程菌不稳定的表现 质粒的丢失（分离稳定性低） 重组DNA片段的脱落（结构稳定性低） 表达产物不稳定 一、工程菌的稳定性 2. 培养条件对工程菌稳定性的影响 （2）比生长速率 基因工程菌的比生长速率一般较宿主菌的比生长速率低，因此用基质浓度等控制比生长速度，有利于质粒的稳定性。 （3）温度 有报道指出重组质粒在导入宿主细胞构建成工程菌后，工程菌生长温度的上限同原宿主菌相比有所下降。通常低温培养往往有利于重组质粒稳定地遗传。 （4）pＨ值和溶解氧 （1）培养基 有报道，培养基营养太丰富，不稳定。 （5）克隆的外源基因表达 许多研究中发现，外源基因的过量表达会引起重组质粒的不稳定。外源基因表达水平越高，重组质粒越不稳定。如果抑制外源基因的表达，则重组质粒不会丢失，工程菌的比生长速率提高。因此，在工程菌的发酵中采用两步法：即在发酵前期抑制外源基因的表达，使重组质粒稳定遗传，在达到一定浓度后，解除抑制，使外源基因高效表达，对发酵是有利的。 （6）施加选择压力 采取施加选择压力的方法消除重组质粒的分配性（质粒丢失）不稳定，以提高菌体纯度和发酵生产率。 二、工程菌发酵工艺 1. 培养基 2. 溶解氧 考虑工程菌稳定性问题，考虑分离纯化问题。最好采用能完全溶解的试剂配制成溶液型、具有一定的选择压力的合成培养基 。 较稀薄的培养基，并通过中间补料提供营养 一般对于需氧的基因工程菌发酵，要求培养液中有足够高的溶解氧，特别是在进行高密度培养时。 工程菌的培养装置既要防止外界微生物侵入发酵罐，污染杂菌，又必须不使重组体外漏 3. 诱导时间的选择 对于采用诱导基因表达和温度调控基因表达的工程菌，发酵过程一般分为生长和表达两个阶段。 4. 设备条件