细胞增殖-毒性实验步骤.docVIP

细胞增殖-毒性实验步骤 1、细胞传代、细胞计数、细胞增殖-毒性实验步骤： 实验准备：用75%酒精擦生物安全柜台面2遍，紫外线消毒30分钟（枪、枪头、15ml及50ml离心管、剪刀、封口膜、记号笔、打火机、酒精灯、培养瓶），复温实验所需试剂[细胞培养液（DMEM、1640）、磷酸缓冲盐溶液（PBS）、胰酶（0.25% Trypsin-EDTA）、胎牛血清（FBS）、双抗]，所有的试剂、仪器放入生物安全柜前要用酒精喷洒消毒。显微镜下看细胞生长状态，有无污染。 1）倒去培养瓶内的培养液； 2）加入PBS 2ml洗涤培养瓶内细胞2次； 3）加入胰酶500ul/0.5ml 2～10min（具体时间因细胞而异，可在显微镜下看是否贴壁，必要时轻拍培养瓶促使细胞脱落）； 4）加入含10%FBS的培养液1～1.5ml[培养液：胰酶=（2～3）:1]中和胰酶； 5）轻轻吹打成单细胞悬液，吹打力度以不起气泡为宜； 6）将单细胞悬液吸入10～15ml离心管中，低速离心800rpm 3分钟，倒去上清液； 7）加入含10%FBS细胞培养液1～2ml吹打悬浮细胞至单细胞悬液； 8）吸取20ul细胞悬液（10ul细胞悬液+10ul台盼兰液：给坏死细胞染色，判断细胞活力）至细胞计数板，进行细胞计数； CCK-8实验： 9）在96孔板中，给每孔加100μL（约7000个）的细胞悬液，将培养板放在培养箱预培养24-72小时（37℃，5%CO2），使细胞贴壁； 10）向培养板中加入10μL不同浓度（5、10、20、40、80、160ug/ml）的待测药物； 11）将培养板在培养箱孵育一段适当的时间24小时（例如：6、12、24或48小时）（药物起作用）； 注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。 12）向每孔加入10μL（约10%）?CCK-8溶液（注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）； 13）将培养板在培养箱内孵育1～4小时（半小时测一次OD值）； 14）用酶标仪测定在450nm处的吸光度。 15）若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10μL?0.1M的HCL溶液或者1%?w/v?SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下24小时内测定，吸光度不会发生变化。 测定待测定药物（6个浓度）对肺癌A549细胞增殖的影响，实验加样（最外围的36孔加PBS液，实际上可用60个孔）： 分组 浓度（ug/ml） 实验组 A加药 GO-CHI-HA-SNX-2112 细胞+培养基+药物+CCK-8 5 ●●● ●● 10 ●●●●● 20 ●●●●● 40 ●●●●● 80 ●●●●● 160 ●●●●● A0加药 细胞+培养基+CCK-8，无药物 ●●●●● A空白 培养基+CCK-8，无细胞、药物 ●●●●● 可不做 药物+培养基+CCK-8，无细胞 ●●● ●● ●●●●● ●●●●● ●●● ●●●●● ●●●●●  小学美术教学改革应立足于理性思考 随着教育改革的不断深化,美育对培养全方面发展的素质人才的作用越发重要,美育?具有开发智力,陶冶情操,培养美感和愉悦身心的作用。美育的基本特征是具有示之以形的形象性,动之以情的情感性和寓教于乐的愉悦性,它的这一特性是其它学科教育所不能取代的。因此如何提高小美术课的教学质量,迫切需要我们美术教师去研究和探讨。现如今在轰轰烈烈的教学改革潮流中,我们更应该立足于理性的思考,而不是一味的赶潮流,走形式。为此笔者结合新课改下的美术教学,谈几点体会与广大同仁商榷。  一,研究教材要有深度,是美术教师上好美术课的前提  过去的教材内容是以传授知识技能为主,教学方法是以灌输为主,而新教材是以学生发展为本,人文的东西起来越来越被人们重视,那就是以人为本。这就是要求我们在教学过程中,尊重和赋予学生更多的自由和权利,发展学生的个性,发掘学生的潜能,使学生的主观能动性和创造性得到充分发挥。我们的教材就是为了体现以上目标而编写的，因此,充分吃透教材的内涵和精神,充分理解教材的编写意图,是美术教师上好美术课的前提.  二,根据教材内容和学生实际情况,制定具体明确的教学目标,是上好美术课的首要环节  教学目标就是船上的舵,它不仅对教学活动设计的方向起指导作用,而且在设计的步骤和方式方法上也具有制约的功能。因此,具体明确的教学目标有利于教师对教学活动的控制,有利于提高教学设计的科学性。个别教师在备课中,考虑了学生的兴趣,想到了创新,但却没有想到自己设计的每一个环节的真正目标。比如,在上小学美术第一册《谁的鱼最大》一课时,有