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高滴度逆转录病毒法转染Raw2647细胞 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：高滴度逆转录病毒法转染Raw2647细胞 1 1 材料与方法 2 2 结果 3 3 讨论 4 文2：不同转染方法对逆转录病毒转染效率影响的研究 4 1 资料与方法 5 2 结 果 6 3 讨 论 6 参考文摘引言： 7 原创性声明（模板） 9 文章致谢（模板） 9 正文 高滴度逆转录病毒法转染Raw2647细胞 文1：高滴度逆转录病毒法转染Raw2647细胞 Abstract：［Objective］To establish a stable and efficient method to trafected cells with target gene.［Methods］Trafect GP2293 cells with pRVCMVGFP and pVSVG by calcium the culture after ultracentrifugation，the viruses were further concentrated to increase the efficiency of gene cells were infected with the viruses.［Results］The viruses concentrated by ultracen trifugation mediated stable and efficient gene trafer. Key words： cells；GFP；pVSVG；virus；trafecttion 是小鼠单核巨噬细胞白血病细胞，源自Abelson鼠科白血病病毒诱导的肿瘤，在 科学 研究过程中有较广泛的应用，如转染基因以建立药物筛选模型。常规的转染方法，如脂质体法、磷酸钙沉降法等，转染细胞效率较低，且多为瞬间转染。逆转录病毒具有制备方便，能够整合到宿主细胞的染色体上，稳定介导基因转移表达等优点，是目前常用的基因转移工具之一［1］。故本研究将含有GFP的逆转录病毒载体与疱疹性口腔炎病毒糖蛋白G基因（vesecular stomatitis virus G glyeoprotein，VSVG）共转染包装细胞系GP2293，收集培养液，经超高速离心浓缩，形成高滴度的病毒，感染细胞，以建立高效稳定转染的细胞系。 1 材料与方法 材料 质粒纯化试剂盒为Qiagen公司产品。细胞株购自 中国 科学院细胞库，GP2293包装细胞系购自Clotech公司。DMEM培养液购自Gibco公司；小牛血清为杭州四季青公司产品。 方法 逆转录病毒的制备（磷酸钙沉淀法） 转染前48h，将GP2293包装细胞（3×106～5×106个）接种于直径为100mm的培养皿中。转染前4小时，先弃去培养液，进饲10ml新鲜DMEM。然后用5%FBS的DMEM培养液洗涤1次，加入5%FBS的DMEM培养液8ml／皿。配制转染液：质粒pRVCMVGFP和pVSVG各10μg用无菌水稀释至450μl，和50μl溶液Ⅰ（ CaCl2）混合于1号管；将溶液Ⅱ（ NaCl， HEPES， Na2HPO4，pH ）逐滴加入1号管，轻轻吹泡混匀，然后室温放置20min。小心地将转染液滴加至细胞上，轻昆匀，置于37℃、3%CO2培养箱中培养8h后，换成新鲜的完全培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。再培养48～72h后，收集上清液，用μm孔径的滤膜过滤，4℃保存备用。 病毒液的浓缩 48h收集转染后GP2293包装细胞培养上清液，保存于4℃冰箱，72h再次收集：取两次收集的该病毒液共100ml，置于低温超高速离心机（HITACHI RP50T）中，4℃，50000g，离心90min弃去上清液，沉淀中加入%～1%原体积的培养基悬浮，得到病毒浓缩液，－70℃保存备用。 病毒浓缩液转染细胞 转染前24h，将细胞（1×105～3×105个／孔）接种于6孔板上。转染时，取病毒浓缩液1ml，加入6孔板中，2个复孔，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，24h后在倒置荧光显微镜下观察GFP荧光。 2 结果 GP2293细胞转染后GFP表达 采用磷酸钙沉降法降pVSVG和pRVCMVGFP共转染GP2293包装细胞，第二天即可在倒置荧光显微镜下观察到较强的绿色荧光见图1。收集病毒上清，经低温超高速离心获得病毒浓缩液。 细胞转染后GFP表达 用病毒浓缩液感染细胞，24h后在荧光显微镜下显示成片绿色荧光见图2。转染细胞在倒置荧光显微镜下挑取表达绿色荧光蛋白的细胞，选取其中6个克隆扩大培养见图3。 3 讨论 随着