细胞实验技术.docVIP

(完好版)细胞实验技术 (完好版)细胞实验技术 PAGE / NUMPAGES (完好版)细胞实验技术 （一）扰乱引物（ shRNA）设计： 1、NCBI 上下载基因序列 2、在 sigema 网站输入基因号设计一对 21 个碱基的扰乱引物（上下游） 3、从开端密码（ ATG）下游 25bp 开始； 4、GC 含量介于 40%~60% 5、扰乱引物起码一个在 SDS区，一个在 3’ UTR区 6、选择脱靶率低的 （二）、扰乱载体建立 1、引物退火（引物加水看标签 X 50,弹匀，瞬离） 退火系统： 上游： 5ul 下游： 5ul 10X M buffer 5ul 2 35ul H O 水浴锅 100℃ 2min ，锅里隔夜 （三）、酶切 plko.1 载体 1、 AgeI 酶切，反响系统： plko.1 载体 4ug AgeI 2ul 10X AgeI buffer 5ul H2 O 39ul 37℃水浴 2~3h 2、切胶回收 AgeI 酶切产物， 30ul 水洗脱 3、 EcoRI酶切，反响系统： AgeI 酶切产物 30ul EcoRI 2ul 10X H buffer 5ul H2 O 13ul 37℃水浴 2~3h 切胶回收， 30ul 水洗脱，测浓度 （四）、连结 连结系统： T4 连结： 退火引物 2ul 退火引物 5ul 酶切载体 1ul 酶切载体 1ul Solution I 5ul T4 连结酶 1ul H2O 2ul T4 连结酶 Buffer 1ul H2O 2ul 室温下连结 4h。 （五）、转变 -80℃取感觉态细胞于冰上消融，在 1.5ml 离心管加 33ul 感觉态，将连结产物加入，冰上搁置 30min ， 42℃ 水浴 60~90s，冰上搁置 2min ，加入无氨苄培育基， 37℃摇床 1h，涂布在氨苄平板上， 37℃， 16h。 （六）、挑菌 用枪头挑取 5 个菌落（可送测序）扩大培育，加有氨苄的培育基， 37℃留宿培育。 （七）、提质粒 碱裂解法是一种应用最为宽泛的制备质粒 DNA 的方法，碱变性抽提质粒 DNA 是鉴于染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性的差别而达到分别目的。 在 pH 值高达 12.6 的碱性条件下， 染色体 DNA 的氢键断裂， 双螺旋构造 解开而变性。质粒 DNA 的大多数氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完好分别，当以 pH4.8 的 NaAc/KAc 高盐缓冲液去调理其 pH 值至中性时，变性的质粒 DNA 又恢复本来的构型，保留在溶液中，而染 色体 DNA 不可以复性而形成缠连的网状构造，经过离心，染色体 DNA 与不稳固的大分子 RNA、蛋白质－ SDS复 合物等一同积淀下来而被除掉。 简洁原理： 碱裂解法是鉴于 DNA 的变性与复性差别而达到分别目的的。 碱性使质粒 DNA 变性，再将 pH 值调至 中性使其复性，复性的为质粒 DNA，而染色体 DNA 不会复性，缠结成网状物质，经过离心除掉。 1、取 5ml 菌液于离心管， 12000 rpm 1min ，弃上清 2、向积淀加 500 ul P1 ，震荡重悬 3、加入 500 ul P2 ，平和翻转 6~8 次，充足裂解 （不超出 5 min，一般 3min ） 4、加入 700 ul P3 ，平和翻转 6~8 次， 出现白色絮状积淀， 12000 rpm 10 min 5、将上清加入 CS柱（已放入采集管）， 12000 rpm 2min ，将采集管中液体加入吸附柱 CP4中， 12000 rpm ， 1min ，弃废液 6、 CP4柱中加入 500 ul PD ,12000rpm ， 1 min ，弃液 7、 CP4柱中加入 600 ul Pw,室温搁置 3 min ,12000rpm ， 1 min ，弃液 8、空离 12000rpm ， 2 min ，室温搁置几分钟（把乙醇蒸发） 9、 CP4柱置于 1.5ml 离心管，向柱中心加 35 ul ddH 2O ，室温搁置 2 min  ， 12000rpm  ，1 min 。 （八）、测质粒浓度 翻开软件， ddH2O 冲洗仪器 3~5 次，点击 black 每个样品汲取 1ul，于仪器上， F1，结果浓度大于 质粒置于 -20 ℃，保留  ， F1，结果不大于 0.2 500， OD 值 1.88~1.90 （九）、细胞复苏 1、 37℃预热  PBS， 取  8ml PBS  于  10 ml  离心管中 2、液氮中拿出冻存的细胞， 37℃水浴消融 3、汲取冻存细胞于 PBS中，轻混匀，室温 800 rpm 3min ，去上清，加入 4、细胞重悬液加到 含 8ml 培育